Hier wird ein Protokoll zur nicht-invasiven mesenchymalen Stammzell-Entbindung (MSC) und Tracking in einem Mausmodell traumatischer Hirnverletzungen vorgestellt. Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel werden als Magnetresonanztomographie (MRT) für die MSC-Kennzeichnung und nicht-invasive in vivo-Tracking nach intranasaler Abgabe mittels Echtzeit-MRT eingesetzt.
Stammzellbasierte Therapien für Hirnverletzungen wie traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein vielversprechender Ansatz für klinische Studien. Technische Hürden wie die invasive Zellabgabe und das Tracking mit geringer Transplantationseffizienz bleiben jedoch Herausforderungen in der translationalen Stammtherapie. Dieser Artikel beschreibt eine aufkommende Technik zur Stammzellkennzeichnung und -verfolgung basierend auf der Kennzeichnung der mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mit superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (SPIO) sowie der intranasalen Abgabe der markierten MSCs. Diese Nanopartikel sind Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-eingebettet und sicher, um die MSCs zu kennzeichnen, die anschließend über den intranasalen Weg an die Gehirne von TBI-induzierten Mäusen geliefert werden. Sie werden dann nicht-in-in-vivo mittels Echtzeit-Magnetresonanztomographie (MRT) nachverfolgt. Wichtige Vorteile dieser Technik, die SPIO für die Zellkennzeichnung und intranasale Abgabe kombiniert, sind (1) nicht-invasives, in vivo MSC-Tracking nach der Verabreichung über lange Tracking-Zeiträume, (2) die Möglichkeit mehrerer Dosierschemas aufgrund der nicht-invasiven Aufgrund der Sicherheit von SPIO, der nichtinvasiven Art der Zellverfolgungsmethode durch MRT und des Verabreichungswegs können (3) mögliche Anwendungen für den Menschen möglich sein.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind attraktive Kandidaten für Stammzell-basierte Therapien bei Derbehandlungen von Erkrankungen des zentralnervensystems (ZNS) und Verletzungen beim Menschen. Darüber hinaus wurden MSCs als Vehikel für die Lieferung von therapeutischen Proteinen an den Verletzungsstellen1,2verwendet. In den letzten Jahren wurden vielversprechende Innovationen entwickelt, um 1) neue Wege der Zellabgabe und 2) Zellverfolgung für Stammzell-basierte Therapien von ZNS-Erkrankungen zu etablieren. Die intranasale Abgabe von Stammzellen in das Gehirn hängt von der Fähigkeit der Zellen ab, die Krippenplatte zu umgehen und teilweise über eine parenchymale Route3in die Riechbirne einzudringen. Die Kombination von intranasaler Abgabe und kennzeichnung von MSCs mit superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (SPIO) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die klinische Anwendung von MSCs bei der Behandlung von CNS-Erkrankungen dar, da SPIO-Nanopartikel sichere Sonden für die Magnetresonanztomographie (MRT) sind und eine nicht-invasive sensitive Längsverfolgung von MSCs nach der Lieferung durch MRT3,4,5ermöglichen. Darüber hinaus ist die intranasale Verabreichung eine sichere und nicht-invasive Route, die eine wiederholte Verabreichung innerhalb kurzer Zeit ermöglicht.
Dieser Artikel beschreibt eine hochsensible und nicht-invasive Technik zur Verfolgung von MSCs in vivo post-intranasal Erzeugnis in einem Mausmodell der traumatischen Hirnverletzung (TBI), das SPIO-markierte Zellen und MRT verwendet. Ein wichtiger Vorteil der SPIO-Kennzeichnung ist der empfindliche Nachweis von SPIO im Gewebe durch MRT, der es ermöglicht, Zellen effizient und nicht-invasiv zu verfolgen. Die hier verwendeten SPIO-Nanopartikel sind im Handel erhältlich und mit einem Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Fluorophor gekennzeichnet, das den Nachweis von SPIO im Gewebe ohne Immunfärbung oder zusätzliche Verarbeitung ermöglicht. Darüber hinaus ist es möglich, Längs-Echtzeit-Tracking durchzuführen und die Bioverteilung der gelieferten MSCs zu untersuchen.
Das hier beschriebene Protokoll stellt allgemeine Verfahren für die SPIO-Kennzeichnung von MSCs und die MRT-Verfolgung von SPIO-markierten MSCs nach der intranasalen Lieferung dar. Das Protokoll bietet die Möglichkeit, die Migration und Bioverteilung von MSCs nach der Geburt in vivo im Gehirn mit einer nicht-invasiven Methode zu untersuchen.
MSCs sind attraktive Kandidaten für Stammzell-basierte Therapien für ZNS-Störungen und Verletzungen aufgrund ihrer Fähigkeit, trophische Faktoren zu sezernieren, die 1) neurorestorative Prozesse auslösen und 2) neuronprodizidenrischen Schutz bieten, aufgrund ihrer entzündungshemmenden Wirkung im Verletzungsbereich9,10,11,12. Obwohl die Langzeit-MRT-Verfolgung und der Nachweis von SPIO-markierten MSCs aufgrund der Verdünnung des interzellulären SPIO mit Zellteilung eingeschränkt sein kann, können markierte Zellen bis zu mehreren Wochen nach der Transplantation im Gehirn von Tiermodellen nachgewiesen werden13.
Ebenfalls hier beschrieben ist das Etikettierungsprotokoll von MSCs mit SPIO-Nanopartikeln, die ohne Transfektionsmittel mit Dextran beschichtet sind. Andere Protokolle wurden in der Literatur verwendet14,15,16. In allen Fällen sollten diese Protokolle jedoch an Zelltyp, SPIO-Größe, Inkubationszeit und SPIO-Konzentration angepasst werden. MSCs haben gezeigt, dass sie das chondrogene Differenzierungspotenzial beeinträchtigt haben, aber keine adipogene Differenzierung bei der SPIO-Kennzeichnung17. Daher wird dringend empfohlen, Differenzierungstests vor der Stammzellabgabe durchzuführen, um den Einfluss von SPIO auf die Differenzierungswirksamkeit von Stammzellen zu bewerten. In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass die MSC-Kennzeichnung mit demselben SPIO-Typ und der gleichen Konzentration, die hier verwendet wird, die osteogene oder adipogene Differenzierungswirksamkeit von MSCs6nicht beeinflusst.
Der intranasale Weg der therapeutischen Stammzellabgabe bei Hirnerkrankungen und Verletzungen ist ein vielversprechender Ansatz für die klinische Anwendung von Stammzellen. Die intrinsischen und molekularen Mechanismen, die das Verhalten von Stammzellen in der Nasenhöhle diktieren, bleiben jedoch unklar. Obwohl der intranasale Weg für die Lieferung kleiner Moleküle weit erforscht ist, unterscheiden sich die Größe und das Bioverteilungsverhalten des therapeutischen Stammes von kleinen Molekülen. Das aktuelle Protokoll zeigt, dass MSCs nach der tranasalen Bereitstellung tendenziell in Richtung der Verletzungsstelle migrieren.
Hier wurden T2*-gewichtete Bilder verwendet, um die SPIO-beschrifteten MSCs zu verfolgen. Andere Berichte haben Gradienten-Echo-Bildgebung verwendet. Jedoch, Anfälligkeit Artefakte werden oft in Gradient Echo Bildgebung durch interzelluläre SPIO beobachtet. Im aktuellen Protokoll war die Position der hypointense Bereiche, die die SPIO-markierten MSCs auf T2*-gewichteten Bildern darstellten, die gleiche wie die Position des SPIO in Hirnabschnitten, wie sie durch histologische Untersuchung festgestellt wurden (Abbildung 3). Dies zeigt die ausreichende Empfindlichkeit der T2*-gewichteten Spin-Echo-Bildgebung für SPIO-markiertem MSC-Tracking im Gehirn an.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das beschriebene Protokoll für in vivo-Stammzellverfolgungsstudien zu Hirnverletzungen und -störungen von Vorteil ist. Die Längsspuren von Stammzellen in vivo wurden traditionell durchgeführt, indem Tiere an mehreren Zeitpunkten geopfert wurden. Das aktuelle Protokoll bietet einen nicht-invasiven und effizienten Ansatz für die Bereitstellung und Verfolgung von MSCs, der ein mögliches Verfahren für die Stammzelltherapie bei Hirnverletzungen und Störungen im klinischen Umfeld darstellt.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (MOST 104-2923-B-038-004 -MY2, MOST 107-2314-B-038-063, und MOST 107-2314-B-038-042) und Taipeh Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400MU, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 und DP2-108-21121-01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |