Отслеживание суперпарамагнитного оксида железа помечены мезенхимальных стволовых клеток с использованием МРТ после интраназальной доставки в травматической модели травмы головного мозга Murine

Все процедуры, связанные с животными в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию с одобрения Комитета по этике по использованию животных в Медицинском университете Тайбэя (утверждение нет. ЛАК-2018-0574; 15.03.2019). 1. Маркировка МСК с помощью наночастиц SPIO Чтобы пометить MSCs с SPIO, добавьте 6 мл маркировки носителей (25 мкг/мл SPIO в модифицированной среде Eagle Dulbecco «DMEM» без сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в колбу T75, содержащую MSC (80% сближания). Инкубировать клетки с маркировки средств в CO2 инкубатор (37 КК, 5% CO2) без тряски. После 24 ч аккуратно удалите носитель маркировки с помощью стерильной пифетки Pasteur с пластиковым наконечником, прикрепленным к вакууму. Вымойте клетки монослой 2x с 6 мл фосфатбуферного солей (PBS), чтобы удалить любые следы неинтернированных SPIO. Чтобы определить, были ли клетки успешно помечены, проверьте помеченные клетки под флуоресцентным микроскопом или конфокальный микроскоп, если SPIO помечены флюорофором (т.е., как те, которые используются здесь; Рисунок 1B, C). Кроме того, выполнить прусское синее окрашивание для клеток (см. шаги 6.2-6.4 для протокола окрашивания). Урожай адептов клеток путем лечения с 3 мл трипсина и инкубировать при 37 градусов по Цельсию. После 5 мин инкубации добавьте 7 мл предварительно разогретых DMEM-носителей с 10% FBS (v/v), чтобы инактивировать трипсин. Соберите подвеску ячейки с помощью пипетки в коническую трубку 15 мл. Центрифугия клеточной подвески на 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend клеточной гранулы в PBS. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипан синий краситель и гемоситометр.ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы помеченных клеток будут отображаться как темный цвет из-за нагрузки железа(рисунок 1D). Этот протокол актуален для маркировки MSC и МРТ-изображения. Процедура маркировки MSC6 была ранее оптимизирована, и только шаги по подготовке помеченных MSC для отслеживания in vivo включены здесь, так как отслеживание in vivo находится в центре внимания. Протокол для культивирования и маркировки других типов клеток должен быть оптимизирован исследователем. Отрегулируйте концентрацию клеток с помощью PBS до 150 000 клеток (или числа, которое приводит к достаточному сигналу МРТ) в 18 Л Л PbS (или общий объем, который будет использоваться в процедуре интраназалальной доставки).ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что концентрация клеток выше 150 000 клеток/18 Л ПБС приводит к агрегации клеток, что может повлиять на эффективность интраназального рода. Если для интраназалальной доставки требуется большее количество клеток, увеличьте общий объем клеточной суспензии и увеличьте количество интраназаальных администраций, так как интраназальное введение является неинвазивной процедурой, и возможно многократное дозирование. 2. Травма контролируемого кортикового воздействия (CCI) ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, мужчины C57 BL/6 мышей (7-8 недель) были сохранены в 12/12 ч свет / темный цикл с объявлением libitum доступ к пище и воде. Чтобы подготовить каждую мышь к травме CcI, вводят золазепам (50 мг/кг) и ксилазин (20 мг/кг) анестезирующий коктейль через интраперитонеальную (т.п.) инъекцию (1 мл/кг). Убедитесь, что глубина анестезии достаточна из-за отсутствия ответа на нос. Кроме того, поместите мышь в камеру поставляется с 2%-4% изолюран для 60с. Бритье меха сонной поверхности черепа между ушами с помощью электронного клипера для волос. Очистите бритую область несколько раз, используя стерильный ватный тампон, пропитанный йодом. Используйте ватный тампон, пропитанный 70% этанола, чтобы очистить йод. Поместите обезожденную мышь в стереотаксическую рамку и закрепите мышь с помощью ушных брусков и носовых брусьев. Сделайте разрез среднего (примерно 2,5 см) в бритой коже с помощью стерильных ножниц для доступа к поверхности черепа. Удалите ткань на кости с помощью ватной палочки, чтобы разоблачить череп. Очистите поверхность черепа с помощью ватного тампона, пропитанного 3% H2O2 на 10 с, а затем очистить его с сухой ватным тампоном.ПРИМЕЧАНИЕ: Швы черепа и брегма и лямбда теперь могут быть легко идентифицированы. Определите координаты выбора на поверхности черепа для повреждения CCI и нарисуйте круг (диаметр 4 мм) вокруг координат с помощью карандаша или правильного маркера.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе координаты при антеропостериоре (AP) -2,0 мм и посредственейке (ML) -1,5 мм использовались для индукции ТПП. Используйте микродриль и круглую заусенцу (диаметр омицировать 0,5 мм), чтобы разбавить череп на отмеченном круге. Избегайте применения давления во время бурения, так как бурение через кость может привести к повреждению мозга паренхимы. Очистите костную пыль с помощью чистого и сухого ватного тампона. Аккуратно удалите костной лоскут с помощью стерильных тонких щипц, чтобы разоблачить dura mater, сохраняя при этом его нетронутым. Удалите мышь из стереотаксической рамы, которая использовалась для подготовки к травмам, и поместите ее в стереотаксическую раму устройства CCI. Стабилизировать голову мыши с помощью ушных прутьев и носовых брусьев. Убедитесь, что головка мыши находится на уровне в ростально-каудальном направлении и при необходимости отрегулируйте носовой решетки. Следуйте инструкциям на поле управления к нулю наконечник удара к открытой корковой поверхности. Убедитесь, что наконечник удара выровнен непосредственно над желаемыми координатами коры головного мозга, чтобы быть затронуты с помощью X и Y управления колесами на базе ударного. Установите параметры эксперимента с помощью коробки управления со скоростью 5 м/с, временем пребывания 250 мс и глубиной травмы 1 мм, чтобы вызвать легкую травму мыши. Вызвать травму, нажав кнопку ”удар’ на коробке управления. Swab любое кровотечение, которое происходит с помощью стерильного ватного тампона. Удалите мышь из стереотаксической рамы и закройте разрез с помощью шелковых хирургических швов. Не используйте металлические зажимы, чтобы закрыть хирургическое место, так как мышь будет подвергаться магнитному полю для МРТ. Применение актуальных антибиотиков (бацитрацин неомицин) в хирургическом месте для предотвращения инфекций. Держите мышь на грелке и внимательно следите за ней во время фазы восстановления. Администрирование кетопрофена (2,5 мг/кг, ИС) ежедневно в течение 3 дней после операции, если администрация кетопрофена не противоречит целям исследования. 3. Интраназальное доставка На 1 день после CCI индукции, вводят золазепам (50 мг/кг) и ксилазин (20 мг/кг) анестезирующий коктейль через i.p. инъекции. Убедитесь, что мышь глубоко обезглавлена из-за отсутствия ответа на нос… Подготовка мыши для интраназалальной доставки MSCs с помощью лечения гиалуронидаза. Возьмите потертости мыши и повернуть на спину твердо, обездвижив череп. Поместите кончик пипетки, содержащей гиалуронидазу в стерильной PBS (4 U/l) вблизи ноздри мыши под углом 45 градусов. В каждой ноздре вводят 3 ЗЛ гиалуронидаза. Держите мышь обездвиженной и лицом вверх на чистую площадку в течение 5 мин. Повторите гиалуронидазу лечения 4x (всего 100 U hyaluronidase подвески). После лечения гиалуронидазой держите обработанную мышь на чистой площадке, обращенной вверх в течение 30 мин. Чтобы доставить MSCs в мозг, держите мышь твердо, как описано в шаге 3.2.1. Администрирование 3 Л/ноздря подвески MSC с интервалом 3 с. Держите мышь в том же положении в течение 30 с, пока образец капель полностью исчезли.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха во время введения. Повторите администрирование с интервалом 2 мин до 3x.ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество клеток, которые будут доставлены составляет 150000, таким образом, что 18 л клеточной подвески могут быть доставлены в дозировке 3 зл для каждой ноздри, 3x каждый. Верните мышь в клетку и внимательно следите за ней, пока она полностью не восстановится от наркоза. 4. В Vivo магнитно-резонансная томография ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическое окрашивание тканей головного мозга ранее использовалось для подтверждения успешной доставки стволовых клеток после интраназального введения. Однако этот метод может быть использован только в качестве конечной точки исследования, а не продольно. Использование МРТ зондов для обозначения терапевтических стволовых клеток позволит продольно, неинвазивным, in vivo отслеживания клеток с помощью МРТ. Важно отметить, что этот протокол эффективно сокращает количество животных, необходимых. В этом протоколе МРТ было проведено в дни 1, 7 и 14 после доставки МСК. Чтобы подготовить мышь для МРТ сканирования, анестезируйте мышь изофлураном (5% изофлуран в 1 л/мин O2 для индукции, 1,5%-2% изофлуран для обслуживания). Выполните щепотку ног, чтобы убедиться, что мышь достигает необходимого уровня анестезии. Поместите мышь на держатель изображения и закрепите его положение с помощью кранов или любого другого надлежащего метода. Переместите держатель в центр катушки МРТ (7 Т/40 см магнита) и подключите контрольное соединение. Чтобы приобрести T2’взвешенное сканирование с помощью последовательности спин-эхо, установите время повторения (TR) до 1500 мс и время эхо (TE) до 2,8 мс. Используйте поле зрения 16 мм x 16 мм (FOV), матрицу приобретения 128 x 128 (MTX) и толщину ломтиков 0,75 х 0,8 мм2 с четырьмя средними сигналами и углом обзора 90 градусов (FA). Уречку держателя мыши из центра катушки МРТ после завершения сканирования. Верните мышь в клетку и внимательно следите за ней, пока она полностью не восстановится от наркоза. Для отслеживания и количественной оценки помеченных MSC на изображениях, взвешенных по T2, используйте программное обеспечение ITK-SNAP (версия 3.8.0)7. Передача необработанных данных МРТ с компьютера аппарата МРТ на компьютер, используемый для анализа в формате DICOM (цифровая визуализация и связь в медицине). Запустите программное обеспечение ITK-SNAP и загрузите МРТ-изображения, нажав на кнопку Файл. Затем нажмите на Open Main Image в меню. Нажмите на кнопку “Открытое изображение” в окне дисплея, а затем найдите и откройте мРТ-изображения с помощью кнопки “Просмотр”.ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация помеченных клеток на МРТ-изображениях будет отображаться как гипоинтенсивные области. Если контраст изображения нуждается в корректировке, выберите Инструменты Контраст изображения. Создавайте сегментации гипоинтенсивных областей и поражений или других частей мозга, выбирая Active Label в разделе сегментационных меток. Используйте различные цвета меток для разных сегментов (если требуется сегментация более чем одной детали). Используйте инструмент Polygon в главной панели инструментов, чтобы нарисовать вокруг гипоинтенсивных областей, представляющих MSCs с маркировкой SPIO. Выберите Принять, расположенный под мРТ-изображением. Сегментированные области будут отображаться как тот же цвет активной метки, назначенной данному сегменту. Повторите этот шаг сегментации для всех срезов МРТ. Разработайте 3D-карту сегментированных областей, чтобы представлять распределение MSC во всем мозге, выбрав инструмент Scalpel в нижней части панели инструментов 3D,расположенную в разделе Сегментация этикетки в нижней части инструментария TheITK-SNAP. Затем нажмите Accept в нижней части созданной 3D-карты. Для выполнения количественного анализа (средний объем и интенсивность) сегментированных гипоинтенсивных областей, представляющих помеченные клетки, нажмите кнопку сегментации в верхней панели и выберите Том и Статистику. 5. Фиксация мозга мыши и криосекция Чтобы исправить мозг мыши, выполнить транскардионную перфузию с 4% параформальдегида (PFA) после последнего МРТ, как ранее описано8. Обезглавить голову и извлечь мозг8. Исправить мозг с 4% ПФА, по крайней мере 48 ч при 4 c. Обезвоживать мозг, погружая его в 30% раствор сахарозы при 4 градусах Цельсия, пока мозг не опустится до нижней части раствора. Встраивай мозг в оптимальный температурный раствор (OCT) и заморозить при температуре -20 градусов. Раздел мозга с криостат микротом на ломтики с толщиной 14 мкм и смонтировать их на слайды. Храните разделы слайдов при -20 градусах цельсия до дальнейшего использования. 6. Прусское голубое окрашивание ПРИМЕЧАНИЕ: Прусское синее окрашивание обычно используется для обнаружения содержания железа в клетках с маркировкой SPIO. Здесь прусское синее окрашивание используется для подтверждения того, что гипоинтенсивные сигналы на изображениях МРТ соответствуют MSC с маркировкой SPIO, а не артефактам. Прусское синее окрашивание является одним из наиболее чувствительных гистохимических методов, используемых для обнаружения железа в тканях и может быть использован для выявления даже одного гранулы железа в клетках. Вымойте слайды секций мозга дистиллированной водой в течение 5 мин. Выполните прусское синее окрашивание, погружая горки в течение 30 минут в раствор окрашивания, который содержит равные части соляной кислоты (10%) и ферроцианид калия (10%) подготовлен непосредственно перед использованием. Вымойте 3x дистиллированной водой, по 5 мин каждый. Противопокой разделы с ядерным быстро красным в течение 5 мин. Промыть горки 2x с дистиллированной водой. Обезвоживать секции постепенно, погружая горки в 95% и 100% алкоголь в течение 2 мин каждый. Добавьте coverslip с resinous монтируя цином. Используйте легкий микроскоп для обнаружения окрашенных клеток в секциях мозга.ПРИМЕЧАНИЕ: Утюг в маркированных клетках будет отображаться как отложения синего цвета.