Presenteras här är ett protokoll för icke-invasiv mesenkymala stamcells (MSC) leverans och spårning i en musmodell av traumatisk hjärnskada. Superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar är anställda som en magnetisk resonanstomografi (MRI) sond för MSC märkning och icke-invasiv in vivo spårning efter intranasal leverans med realtid MRI.
Stamcells-baserade terapier för hjärnskador, såsom traumatisk hjärnskada (TBI), är en lovande metod för kliniska prövningar. Men tekniska hinder som invasiv cell leverans och spårning med låg transplantations effektivitet är fortfarande utmaningar i translationell Stem-baserad terapi. Denna artikel beskriver en ny teknik för stamcells märkning och spårning baserat på märkning av mesenkymala stamceller (MSCs) med superparamagnetiska järnoxid (SPIO) nanopartiklar, samt intranasal leverans av den märkta MSCs. Dessa nanopartiklar är fluorescein isotiocyanat (FITC)-inbäddade och säkra att märka MSCs, som därefter levereras till hjärnor TBI-inducerad möss av intranasal rutten. De spåras sedan icke-invasivt in vivo av realtid magnetisk resonanstomografi (MRI). Viktiga fördelar med denna teknik som kombinerar SPIO för cell märkning och intranasal leverans inkluderar (1) icke-invasiv, in vivo MSC-spårning efter leverans för långa uppföljnings perioder, (2) möjligheten av flera doseringsregimer på grund av den icke-invasiva väg av MSC leverans, och (3) möjliga ansökningar till människor, på grund av säkerheten för SPIO, icke-invasiv karaktär av cell-tracking metod av MRI, och administreringsväg.
Mesenkymala stamceller (MSC) är attraktiva kandidater för stamcells-baserade terapier i behandlingar av centralanervsystemet (CNS) sjukdomar och skador hos människor. Dessutom har MSCS använts som ett medel för tillförsel av terapeutiska proteiner vid skade ställen1,2. Under de senaste åren har lovande innovationer utvecklats för att etablera 1) nya vägar för cell leverans och 2) cell spårning för stamcells-baserade terapier av CNS-störningar. Den intranasala leveransen av stamceller till hjärnan beror på förmågan hos celler att kringgå cribriform plattan och ange luktbulben delvis via en parenkymal Route3. Kombinationen av intranasal leverans och märkning av MSCS med superparamagnetisk järnoxid (spio) nanopartiklar utgör en lovande metod för kliniska tillämpningar av MSCS vid behandling av CNS-störningar, eftersom spio nanopartiklar är säkra sonder för magnetisk resonanstomografi (MRI) och tillåta icke-invasiv känslig longitudinell spårning av MSCS efter leverans av MRI3,4,5 Dessutom är intranasal leverans en säker och icke-invasiv väg som möjliggör upprepad administrering inom en kort tidsperiod.
Denna artikel beskriver en mycket känslig och icke-invasiv teknik för att spåra MSCs in vivo post-intranasal leverans i en musmodell av traumatisk hjärnskada (TBI), som sysselsätter SPIO-märkta celler och MRI. En viktig fördel med SPIO-märkningen är den känsliga detekteringen av SPIO i vävnad av MRI, vilket gör det möjligt att spåra celler effektivt och icke-invasivt. Den SPIO nanopartiklar som används här är kommersiellt tillgängliga och märkta med en fluorescein isotiocyanat (FITC) fluorophore, som gör det möjligt för detektion av SPIO i vävnad utan immunofärgning eller ytterligare bearbetning. Dessutom är det möjligt att utföra longitudinell realtidsspårning och undersöka bio distributionen av de levererade MSCs.
Det protokoll som beskrivs här representerar allmänna procedurer för SPIO märkning av MSCs och MRI-spårning av SPIO-märkt MSCs post-intranasal leverans. Protokollet ger möjlighet att studera migration och biodistribution av MSCs efter leverans in vivo i hjärnan, med hjälp av en icke-invasiv metod.
MSCS är attraktiva kandidater för stamcells-baserade terapier för CNS-störningar och skador på grund av deras förmåga att utsöndra trofiska faktorer som 1) utlösa neurorestorative processer och 2) ger neuroprotection, på grund av deras antiinflammatoriska effekter inom skadeområdet9,10,11,12. Även om långsiktig MRI-spårning och detektion av SPIO-märkta MSCs kan begränsas på grund av utspädning av intercellulära SPIO med celldelning, kan märkta celler detekteras i upp till flera veckor efter transplantation i hjärnan hos djurmodeller13.
Beskrivs också här är märkningen protokoll MSCs med SPIO nanopartiklar belagda med dextran utan transfektion agenter. Andra protokoll har använts i litteraturen14,15,16. Emellertid, i alla fall, dessa protokoll bör justeras för celltyp, SPIO storlek, inkubationstid, och SPIO koncentration. MSCS har visat sig ha nedsatt chondrogenic differentiering potential men inte adipogen differentiering på spio märkning17. Därför är det starkt rekommenderat att differentiering analyser utföras före stamcells leverans för att utvärdera påverkan av SPIO på differentieringen potensen av stamceller. I en tidigare studie visade det sig att MSC-märkning med samma SPIO-typ och koncentration som används i här påverkade inte den Osteogena eller adipogena differentierings styrkan hos MSCs6.
Den intranasala vägen för terapeutisk stamcells leverans för hjärnsjukdomar och skador är en lovande metod för den kliniska tillämpningen av stamceller. Men de inneboende och molekylära mekanismerna som dikterar beteendet hos stamceller i näshålan förblir oklara. Även om den intranasala rutten är allmänt utforskad för leverans av små molekyler, storlek och biodistribution beteende av den terapeutiska stammen skiljer sig från små molekyler. Det aktuella protokollet visar att MSCs tenderar att migrera mot skada plats efter intranasal leverans.
Här användes T2 *-viktade bilder för att spåra de SPIO-märkta MSCs. Andra rapporter har använt toning ECHO Imaging. Dock observeras mottaglighet artefakter ofta i gradient ECHO Imaging på grund av intercellulära SPIO. I det aktuella protokollet var placeringen av de hypoinspända områden som representerar SPIO-märkta MSCs på T2 *-viktade bilder densamma som placeringen av SPIO i hjärn sektioner som upptäcktes av Histologisk undersökning (figur 3). Detta indikerar tillräcklig känslighet för T2 *-vägd spin ECHO Imaging för SPIO-märkta MSC tracking i hjärnan.
Sammanfattnings, det beskrivna protokollet är fördelaktigt för in vivo stamcells spårning studier av hjärnskador och sjukdomar. Den longitudinella spårningen av stamceller in vivo har traditionellt utförts genom att offra djur vid flera tidpunkter. Det nuvarande protokollet ger en icke-invasiv och effektiv metod för MSCs leverans och spårning, som representerar en potentiell procedur för stamcells-baserad terapi för hjärnskador och störningar i kliniska inställningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik bidrag, Taiwan (de flesta 104-2923-B-038-004-MY2 nätters, de flesta 107-2314-B-038-063, och de flesta 107-2314-B-038-042) och Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 och DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |