Aquí se presenta un protocolo para la entrega y seguimiento de células madre mesenquimales no invasivas (MSC) en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético se emplean como una sonda de resonancia magnética (RM) para el etiquetado de MSC y el seguimiento in vivo no invasivo después de la administración intranasal mediante RMN en tiempo real.
Las terapias basadas en células madre para lesiones cerebrales, como lesiones cerebrales traumáticas (TBI, por sus aires), son un enfoque prometedor para los ensayos clínicos. Sin embargo, los obstáculos técnicos como el parto de células invasivas y el seguimiento con baja eficiencia de trasplante siguen siendo desafíos en la terapia traslacional basada en el tallo. Este artículo describe una técnica emergente para el etiquetado y seguimiento de células madre basada en el etiquetado de las células madre mesenquimales (MSC) con nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO), así como la entrega intranasal de los MSC etiquetados. Estas nanopartículas son incrustadas en isotiocianato de fluoresceína (FITC) y son seguras para etiquetar los MSC, que posteriormente se entregan a los cerebros de ratones inducidos por TBI por la vía intranasal. A continuación, se les realiza un seguimiento in vivo no invasivo mediante imágenes por resonancia magnética (RM) en tiempo real. Las ventajas importantes de esta técnica que combina SPIO para el etiquetado celular y la entrega intranasal incluyen (1) seguimiento in vivo no invasivo después del parto durante largos períodos de seguimiento, (2) la posibilidad de múltiples regímenes de dosificación debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes de dosificación múltiple debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes de dosificación múltiple debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes de dosificación múltiple debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes de dosificación múltiple debido a los regímenes no invasivos debido a los regímenes no invasivos debido a vía de entrega de MSC, y (3) posibles aplicaciones a los seres humanos, debido a la seguridad del SPIO, la naturaleza no invasiva del método de seguimiento celular por RMN y la vía de administración.
Las células madre mesenquimales (MSC) son atractivas candidatas para terapias basadas en células madre en tratamientos de trastornos y lesiones del sistema nervioso central (SNC) en humanos. Además, los MSC se han utilizado como vehículo para la entrega de proteínas terapéuticas en los sitios de lesión1,2. En los últimos años, se han desarrollado innovaciones prometedoras para establecer 1) nuevas vías de entrega celular y 2) seguimiento celular de terapias basadas en células madre de trastornos del SNC. La entrega intranasal de células madre en el cerebro depende de la capacidad de las células para pasar por alto la placa cribriforme y entrar en la bombilla olfativa parcialmente a través de una ruta parénquimal3. La combinación de la administración intranasal y el etiquetado de los MCS con nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) representa un enfoque prometedor para las aplicaciones clínicas de los MCS en el tratamiento de los trastornos del SNC, ya que las nanopartículas SPIO son sondas seguras para imágenes por resonancia magnética (RM) y permiten el seguimiento longitudinal no invasivo sensible de los MCS después de la entrega mediante RM33,4,5. Además, el parto intranasal es una vía segura y no invasiva que permite la administración repetida en un corto período de tiempo.
Este artículo describe una técnica altamente sensible y no invasiva para el seguimiento de los MCS en el parto post-intranasal in vivo en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática (TBI), que emplea células etiquetadas por SPIO y RMN. Una ventaja importante del etiquetado SPIO es la detección sensible de SPIO en el tejido mediante RMN, que permite rastrear las células de manera eficiente y no invasiva. Las nanopartículas SPIO utilizadas aquí están disponibles comercialmente y etiquetadas con un fluoresceína isotiocianato (FITC) fluoróforo, que permite la detección de SPIO en tejido sin inmunostaining o procesamiento adicional. Además, es posible realizar un seguimiento longitudinal en tiempo real e investigar la biodistribución de los MSC entregados.
El protocolo descrito aquí representa procedimientos generales para el etiquetado SPIO de los MCS y el seguimiento de la RMN de los MSC etiquetados con SPIO después de la entrega intranasal. El protocolo permite estudiar la migración y biodistribución de los MSC después de la entrega in vivo en el cerebro, utilizando un método no invasivo.
Los MSC son candidatos atractivos para terapias basadas en células madre para trastornos y lesiones del SNC debido a su capacidad para secretar factores tróficos que 1) desencadenan procesos neurorrestorativos y 2) proporcionan neuroprotección, debido a sus efectos antiinflamatorios dentro del área de lesiones9,10,11,12. Aunque el seguimiento y la detección de resonancias magnéticas a largo plazo de los MCS etiquetados por SPIO pueden ser limitados debido a la dilución del SPIO intercelular con la división celular, las células etiquetadas pueden detectarse hasta varias semanas después del trasplante en los cerebros de los modelos animales13.
También se describe aquí el protocolo de etiquetado de los MSC con nanopartículas SPIO recubiertas con deextran sin agentes de transfección. Otros protocolos se han utilizado en la literatura14,15,16. Sin embargo, en todos los casos, estos protocolos deben ajustarse para el tipo de celda, el tamaño del SPIO, el tiempo de incubación y la concentración de SPIO. Se ha demostrado que los MSC han deteriorado el potencial de diferenciación condrogénica, pero no la diferenciación adipogénica en el etiquetado SPIO17. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente que los ensayos de diferenciación se realicen antes de la entrega de células madre para evaluar la influencia del SPIO en la potencia de diferenciación de las células madre. En un estudio anterior, se demostró que el etiquetado DE MSC con el mismo tipo de SPIO y concentración utilizado en el presente no afectaba a la potencia de diferenciación osteogénica o adipogénica de los MSC6.
La vía intranasal de la entrega terapéutica de células madre para trastornos cerebrales y lesiones es un enfoque prometedor para la aplicación clínica de células madre. Sin embargo, los mecanismos intrínsecos y moleculares que dictan los comportamientos de las células madre en la cavidad nasal siguen sin estar claros. Aunque la vía intranasal es ampliamente explorada para la administración de moléculas pequeñas, el tamaño y el comportamiento de biodistribución del tallo terapéutico difieren de moléculas pequeñas. El protocolo actual demuestra que los MSC tienden a migrar hacia el sitio de la lesión después del parto intranasal.
Aquí, se utilizaron imágenes ponderadas por T2* para rastrear los MSC etiquetados por SPIO. Otros informes han utilizado imágenes de eco de gradiente. Sin embargo, los artefactos de susceptibilidad a menudo se observan en imágenes de eco de gradiente debido al SPIO intercelular. En el protocolo actual, la ubicación de las áreas hipointensas que representan los MSC etiquetados por SPIO en imágenes ponderadas por T2* fue la misma que la ubicación del SPIO en secciones cerebrales detectadas por el examen histológico(Figura 3). Esto indica la sensibilidad adecuada de las imágenes de eco de giro ponderadas por T2* para el seguimiento de MSC etiquetado por SPIO en el cerebro.
En resumen, el protocolo descrito es beneficioso para los estudios de seguimiento de células madre in vivo de lesiones y trastornos cerebrales. El seguimiento longitudinal de las células madre in vivo se ha realizado tradicionalmente sacrificando animales en múltiples puntos de tiempo. El protocolo actual proporciona un enfoque no invasivo y eficiente para la entrega y el seguimiento de los CCR, que representa un procedimiento potencial para la terapia basada en células madre para lesiones y trastornos cerebrales en entornos clínicos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Subvenciones científicas y tecnológicas, Taiwán (MOST 104-2923-B-038-004 -MY2, MOST 107-2314-B-038-063, y MOST 107-2314-B-038-042) y Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 y DP2-108-21121-01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |