Presentert her er en protokoll for ikke-invasiv mesenchymal Stem Cell (MSC) levering og sporing i en mus modell av traumatisk hjerneskade. Superparamagnetic jernoksid nanopartikler anvendes som en MRI-sonde (magnetisk resonans imaging) for MSC-merking og ikke-invasiv in vivo-sporing etter intranasal levering med sann tids MRI.
Stem Cell-baserte terapier for hjerne skader, slik som traumatisk hjerneskade (TBI), er en lovende tilnærming for kliniske studier. Men tekniske hekk som invasiv celle levering og sporing med lav transplantasjon effektivitet fortsatt utfordringer i translational Stem-basert terapi. Denne artikkelen beskriver en ny teknikk for stilk cellen merking og sporing basert på merking av Mesenchymal stamceller (MSCs) med superparamagnetic jernoksid (SPIO) nanopartikler, samt intranasal levering av merket MSCs. Disse nanopartikler er fluorescein isothiocyanate (FITC)-embedded og trygt å merke MSCs, som senere leveres til hjernen av TBI-indusert mus av intranasal ruten. De spores deretter ikke-invasivt in vivo av magnetisk resonans (MRI) i sanntid. Viktige fordeler med denne teknikken som kombinerer SPIO for cellemerking og intranasal levering inkluderer (1) ikke-invasiv, in vivo MSC-sporing etter levering for lange oppfølgingsperioder, (2) muligheten for flere doseringsregimer på grunn av de ikke-invasive veien for MSC levering, og (3) mulige søknader til mennesker, på grunn av sikkerheten til SPIO, ikke-invasiv karakter av cellen-sporing metoden ved MRI, og administrasjonsvei.
Mesenchymal stamceller (MSC) er attraktive kandidater for stilk cellen-basert terapi i behandlinger av sentralnervesystemet (CNS) lidelser og skader hos mennesker. Videre har MSCs blitt brukt som et redskap for levering av terapeutiske proteiner ved skadeområder1,2. I de senere årene har lovende innovasjoner er utviklet for å etablere 1) romanen ruter av celle levering og 2) celle sporing for stilk cellen-basert behandling av CNS lidelser. Den intranasal levering av stamceller inn i hjernen avhenger av evnen til celler til å omgå cribriform plate og angi olfactory pære delvis via en parenkymatøs rute3. Kombinasjonen av intranasal levering og merking av MSCs med superparamagnetic jernoksid (SPIO) nanopartikler representerer en lovende tilnærming for kliniske anvendelser av MSCs i behandling av CNS lidelser, siden SPIO nanopartikler er trygge sonder for magnetisk resonans imaging (MRI) og tillate ikke-invasiv følsom langsgående sporing av MSCs etter levering av MRI3,4,5. Videre er intranasal levering en trygg og ikke-invasiv rute som tillater gjentatt administrering i løpet av en kort tidsperiode.
Denne artikkelen beskriver en svært følsom og ikke-invasiv teknikk for å spore MSCs in vivo post-intranasal levering i en musemodell av traumatisk hjerneskade (TBI), som sysselsetter SPIO-merket celler og MRI. En viktig fordel med SPIO merking er sensitiv påvisning av SPIO i vev av MRI, som gjør det mulig å spore celler effektivt og ikke-invasivt. Den SPIO nanopartikler brukes her er kommersielt tilgjengelig og merket med en fluorescein isothiocyanate (FITC) fluoroforen, som gjør det mulig for påvisning av SPIO i vev uten immunostaining eller ytterligere behandling. Videre er det mulig å utføre langsgående sanntids sporing og undersøke biodistribusjon av leverte MSCs.
Protokollen beskrevet her representerer generelle prosedyrer for SPIO merking av MSCs og Mr sporing av SPIO-merket MSCs post-intranasal levering. Protokollen gir mulighet til å studere migrasjon og biodistribusjon av MSCs etter levering in vivo i hjernen, ved hjelp av en ikke-invasiv metode.
MSCs er attraktive kandidater for stilk cellen-basert terapi for CNS lidelser og skader på grunn av deres evne til å skille trofiske faktorer som 1) utløse neurorestorative prosesser og 2) gi neuroprotection, på grunn av deres antiinflammatoriske effekter innenfor skaden området9,10,11,12. Selv om langsiktig Mr-sporing og påvisning av SPIO-merket MSCs kan begrenses på grunn av fortynning av intercellulære SPIO med celledeling, merket celler kan oppdages for opptil flere uker etter transplantasjon i hjernen av dyremodeller13.
Også beskrevet her er merkingen protokollen av MSCs med SPIO nanopartikler belagt med dextran uten transfeksjoner agenter. Andre protokoller har blitt brukt i litteraturen14,15,16. I alle tilfeller bør imidlertid disse protokollene justeres for celle type, SPIO-størrelse, inkubasjons-tid og SPIO-konsentrasjon. MSCs har vist å ha nedsatt chondrogenic differensiering potensial, men ikke adipogenic differensiering på SPIO merking17. Derfor er det sterkt anbefalt at differensiering analyser utføres før Stamcelle levering å evaluere påvirkning av SPIO på differensiering styrken av stamceller. I en tidligere studie ble det demonstrert at MSC merking med samme SPIO type og konsentrasjon som brukes i her ikke påvirke osteogen eller adipogenic differensiering potens av MSCs6.
Den intranasal ruten av terapeutisk stilk cellen levering for hjerne lidelser og skader er en lovende tilnærming for klinisk anvendelse av stamceller. Men den iboende og molekylære mekanismer som dikterer oppførselen til stamceller i nesehulen forblir uklart. Selv om den intranasal ruten er allment utforsket for levering av små molekyler, er størrelsen og biodistribusjon atferden til den terapeutiske stammen forskjellig fra små molekyler. Den gjeldende protokollen viser at MSCs har en tendens til å migrere mot skaden området etter intranasal levering.
Her ble T2 *-vektet bilder brukt til å spore SPIO-merket MSCs. Andre rapporter har brukt gradient Echo Imaging. Imidlertid er mottakelighet gjenstander ofte observert i gradient ekko Imaging grunn intercellulære SPIO. I den gjeldende protokollen, plasseringen av hypointense områder som representerer SPIO-merket MSCs på T2 *-vektet bilder var den samme som plasseringen av SPIO i hjernen seksjoner som oppdages av histologiske undersøkelse (Figur 3). Dette indikerer tilstrekkelig følsomhet for T2 *-vektet spin Echo Imaging for SPIO-merket MSC sporing i hjernen.
Oppsummert er den beskrevne protokollen gunstig for in vivo stilk cellen sporing studier av hjernen skader og lidelser. Den langsgående sporing av stamceller in vivo har tradisjonelt blitt utført ved å ofre dyr på flere tidspunkter. Den nåværende protokollen gir en ikke-invasiv og effektiv tilnærming for MSCs levering og sporing, som representerer en potensiell prosedyre for stilk cellen-basert terapi for hjerne skader og lidelser i kliniske miljøer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi Grants, Taiwan (mest 104-2923-B-038-004-MY2, MOST 107-2314-B-038-063, og mest 107-2314-B-038-042) og Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 og DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |