In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decifrar onde e como a informação é adquirida no cérebro através da aprendizagem e, posteriormente, armazenada como memória constitui uma das tarefas mais desafiadoras na neurociência¹. A pesquisa neurocientífica levou ao conceito de mudança na transmissão sináptica como substrato neuronal que está subjacente à formação de aprendizagem e memória^2,3. É supor que, durante a aprendizagem, as conexões sináptica entre os conjuntos neuronal que são ativos durante a percepção de um estímulo tornam-se modificados de modo que seu teste padrão combinado da atividade possa ser recuperado durante a recordação da memória, assim instruindo ação comportamental futura⁴. Estas “células Engram” e suas sinapses são muitas vezes distribuídas entre as regiões cerebrais e os níveis de processamento, o que dificulta a atribuição de alterações observadas na transmissão sináptica para a aprendizagem de uma tarefa ou um estímulo. Para localizar e Visualizar essas alterações sinápticas que são causalmente ligadas a uma tarefa de aprendizado específica, uma precisa de um sistema de modelo adequado que permita confinar precisamente essas sinapses.

Para tal empreendimento, a Drosophila melanogaster é particularmente adequada porque combina a simplicidade relativa do cérebro, a riqueza comportamental e a acessibilidade experimental. Entre os organismos modelo bem estabelecidos, a Drosophila está situada entre o nematódeo C. elegans e mamíferos geneticamente tratável como camundongos em termos de complexidade neuronal. O número estereotipado de neurônios (~ 300) e o repertório comportamental limitado é observado em C. elegans. Os mamíferos, por outro lado, têm milhões de neurônios e uma complexidade comportamental surpreendente. O cérebro da mosca da fruta é, com o seu ~ 100.000, neurônios significativamente menores do que os cérebros da maioria dos vertebrados, e muitos dos neurônios são individualmente identificáveis⁵. No entanto, a Drosophila demonstrar um amplo espectro de comportamentos complexos, incluindo uma capacidade de apresentar formação olfatória associativa robusta e de memória, descrita pela primeira vez há mais de 40 anos⁶. No decorrer deste procedimento de condicionamento clássico, grupos de moscas são submetidos a um odor como o estímulo condicionado (CS⁺), enquanto eles recebem um choque elétrico punindo como o estímulo não condicionado (EUA). Um segundo odor (CS^–) é então apresentado sem qualquer punição. Assim, os animais aprendem a evitar o odor associado com a punição, que pode ser testado em uma situação de escolha subsequente entre os dois odores, CS⁺ e cs^–. O trabalho na dissecação do substrato neuronal subjacente a esse comportamento na Drosophila identificou os corpos de cogumelos (MB) como o local primário do “Engram”^7,8,9,10 e, portanto, o circuito desta região cerebral foi e é objeto de intensa pesquisa, a fim de desvendar a lógica pela qual um engrama de memória é adquirido e armazenado (recentemente revisado em^11,12).

A Drosophila MB consiste em ~ 2.000 neurônios intrínsecos (células de Kenyon) por hemisfério, organizados em projeções axonais paralelas¹³. Os axônios dos neurônios de projeção olfativa são estendidos ao protocerebra lateral e aos calyces do MB, o local de entrada dendrítico principal do MB e recebem a entrada olfactory dos lóbulos sensilas. O feixe longo, paralelo dos axônios de pilhas de Kenyon constituem o pedúnculo e os lóbulos. A maioria das células de Kenyon bifurcate formando β/β’-lóbulos horizontais, estendendo uma colateral para a linha média do cérebro, e os lobos verticais α/α’-por estender a segunda garantia projetando na direção dorsal-anterior. O outro grupo de células de Kenyon forma os γ-lóbulos horizontais¹³ do MB onde o processo de aprendizagem e a formação subseqüente da memória a curto prazo podiam ser localizados¹⁰. Os lóbulos MB recebem entrada aferente e proporcionam saída eferente, ambos tipicamente restritos a distintas sub-regiões compartimental ao longo dos axônios da célula de Kenyon^14,15,16. Em particular, os neurônios de entrada de MB dopaminérgicos aferentes têm sido mostrados para mediar os efeitos baseados em valor, por exemplo, PUNITIVOS, reforçando na aprendizagem olfatória associativa^15,17. Os neurônios de saída de MB eferentes estereotípicos e individualmente identificáveis dos lóbulos de corpo de cogumelo integram informações em um grande número de células Kenyon, segmentam diversas áreas cerebrais e carregam informações apetitoso ou aversivas de comportamento-instrutiva¹⁵ . Esta arquitetura neuronal conduziu a um conceito da organização do Engram associativo. Os odores são codificados relativamente precisamente por conjuntos escassamente ativados de células de Kenyon. A atividade coincidente destes conjuntos de células de Kenyon e liberação de dopamina-evocado por punindo estímulos-modula transmissão de células de Kenyon presynapses em MB neurônios de saída, de tal forma que os animais irão subsequentemente evitar este cheiro particular^{10 ,12}. Nós usamos este engrama rather precisamente definido e localizado como um caso paradigmática para ilustrar como estas mudanças aprendizagem-dependentes na atividade sináptica podem ser determinadas e monitoradas.

O valor de Drosophila como um sistema modelo confia fortemente na caixa de ferramentas genética incomparável que permite que um expresse transgenes para identificar, monitorar, e controlar únicos neurônios dentro dos circuitos complexos¹⁸. O advento de técnicas de monitoramento de atividade neuronal-como a imagem de cálcio, discutido aqui-permitiu a determinação de padrões de atividade neuronal em resposta a um estímulo específico. Combinando a expressão Gal4-driven específica de indicadores genetically codificados do cálcio (GECIs) com estimulação olfactory, uma pode visualizar a dinâmica odor-evocada do cálcio dos neurônios do interesse¹⁹. Neste protocolo, mostra-se que, ao acoplar essa técnica com um paradigma de condicionamento clássico, é possível examinar essas respostas olfativas no contexto da aprendizagem. A plasticidade induzida pela aprendizagem pode ser mais dissecada usando GECIs que não são apenas localizadas a um único Neuron específico, mas também a subcompartimentos específicos de um Neuron. Pech et al.²⁰ estabeleceram uma seleção de ferramentas que permitem exatamente isso. Alvejando o GCaMP3²¹ ao pre-ou ao postsynapse-através da ligação ao vertebrados synaptophysin ou ao Homer de d, respectivamente²⁰-a modulação diferencial destes locais pode ser distinguida. Esta localização confere, neste contexto, uma vantagem sobre a maioria dos GECIs que estão presentes em todo o citosol-por exemplo, GCaMP²², GCaMP3²¹, ou GCaMP6²³ -porque significa que os transientes pré e pós-sinápticos podem ser distinto do influxo integrado geral do cálcio que ocorre em conseqüência da ativação do neurônio. Isso pode fornecer pistas sobre a localização e os tipos de plasticidade que ocorrem como resultado de ou que causam a formação de aprendizagem e memória. Como um exemplo, o protocolo fornecido aqui mostra o valor desta ferramenta em decifrar a modulação de neurônios de saída MB durante a aprendizagem associativa olfatória, direcionando a expressão do sensor de cálcio para apenas o postsynapse. Monitorando, dentro de uma mosca individual, atividade odor-evocada antes e depois do condicionamento olfactory uma comparação direta pode ser extraída entre uma resposta ingênua do odor e uma resposta aprendida do odor. Embora fixado na mesma Câmara de imagem, as moscas são expostas a uma seleção de odores. Em seguida, eles recebem um protocolo de condicionamento associativo aversivo em que um desses odores é emparelhado com choque elétrico (tornando-se o CS⁺) e outro odor é apresentado sem reforço (tornando-se o cs^–). Finalmente, as moscas são novamente expostos aos mesmos odores como na primeira etapa. A dinâmica do cálcio é observada usando microscopia de dois fótons.