초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

학습을 통해 뇌에서 정보를 획득하고 메모리로 저장하는 위치와 방법을 해독하는 것은 신경^과학1에서 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 신경과학 연구는 학습과 기억 형성의 기초가 되는 신경 기질로서 시냅스 전송의 변화의 개념을 주도하고 있다^2,3. 그것은 가설, 학습 하는 동안, 자극의 인식 동안 활성화 되는 신경 앙상블 간의 시 냅 스 연결 메모리 회수 하는 동안 그들의 결합 된 활동 패턴을 검색할 수 있도록 수정 될, 따라서 지시 향후 행동 행동⁴. 이러한 “engram 세포” 그리고 그들의 시 냅 스는 종종 뇌 영역 및 처리의 수준에 걸쳐 배포, 작업 또는 자극의 학습에 시 냅 스 전송에 관찰 된 변화를 할당 하기 어려운. 특정 학습 작업에 인가적으로 연결된 시냅스 변화를 지역화하고 시각화하려면 시냅스를 정확하게 제한하는 적절한 모델 시스템이 필요합니다.

이러한 노력을 위해, Drosophila 멜라노가스터는 상대적인 두뇌 단순성, 행동 풍요로움 및 실험적 접근성을 결합하기 때문에 특히 적합합니다. 잘 확립 된 모델 유기체 중, Drosophila는 선충 C. 예쁜 꼬마와 신경 복잡성의 관점에서 마우스와 같은 유전적으로 견인 포유 동물 사이에 위치하고 있습니다. 뉴런 (~300)과 제한된 행동 레퍼토리의 입체 수는 C. elegans에서 관찰됩니다. 포유류는, 다른 한편으로는, 뉴런의 수백만있고 엄청난 행동 복잡성이 있습니다. 과일 파리의 뇌는 ~ 100,000, 대부분의 척추 동물의 뇌보다 훨씬 작은 뉴런, 그리고 뉴런의 대부분은 개별적으로 식별 할 수^{있습니다 5}. 그러나, Drosophila는 40 년 전에 처음 기술된 강력한 연관 후각 학습 및 기억 형성을 전시하는 기능을 포함하여 복잡한 행동의 넓은 스펙트럼을 보여줍니다^6. 이 고전적인 컨디셔닝 절차의 과정에서, 파리의 그룹은 조건부 자극 (CS^+)으로냄새를 받게되고 무조건 자극 (미국)으로 처벌 전기 충격을받습니다. 두 번째 냄새 (CS^{– )}는 어떤 처벌없이 제시된다. 이에 의해, 동물들은 처벌과 관련된 악취를 피하는 법을 배워, 이는 두 냄새,^{CS+및 CS-사이의}후속 선택 상황에서 시험될 수 있다. Drosophila에서 이 행동의 밑에 있는 신경 기질해저에 대한 연구는 버섯 바디 (MB)를 “engram”^{7,8,9,10의 1차 부위로 확인했습니다} 따라서, 이 뇌 영역의 회로는 메모리 엔그램이 획득되고 저장되는 논리를 밝히기 위해 강렬한 연구의 대상이되고 있다 (최근^11,12에서검토).

Drosophila MB는 반구당 ~2,000개의 본질적인 뉴런(Kenyon cells)으로 구성되어 있으며, 축삭^{돌출부 13으로}구성된다. 후각 프로젝션 뉴런의 축삭은 MB의 주요 수지상 입력 부위인 MB 칼릭스및 안테나 로브로부터 후각 입력을 수신하는 측면 프로토세레브라 및 MB 칼리세스로 확장된다. 케년 세포의 길고 평행한 축삭 번들은 페던클과 로브를 구성한다. 대부분의 케년 세포는 수평 β/β’-로브를 형성하여 뇌의 중간선쪽으로 하나의 부수적인 것을 확장하고, 등쪽 전방 방향으로 두 번째 부수적 인 투영을 연장시킴으로써 수직 α/α’-로브를 형성합니다. 케년 세포의 다른 그룹은 학습 과정 및 후속 단기 기억 형성이 국소화 될 수있는 MB의 수평 γ-로브^{(13)를 형성한다 10.} MB 로브는 구심성 입력을 수신하고 원심성 출력을 제공하며, 둘 다 일반적으로 케니언 셀 축삭^14,15,16을따라 뚜렷한 구획 하위 영역으로 제한된다. 특히, 구심성 도파민성 MB 입력 뉴런은 부가가치 기반, 예를 들어, 연관후각 학습에서 징벌적, 강화 효과를 중재하는 것으로 나타났다^15,17. 버섯 체외로부터 의기질적이고 개별적으로 식별 가능한 원추형 MB 출력 뉴런은 많은 수의 케니언 세포에 걸쳐 정보를 통합하고, 다양한 뇌 영역을 표적으로 하며, 행동-유익한 식욕 또는 비열한 정보를 지니고^{있습니다 15} . 이러한 뉴런 아키텍처는 연관 엔그램의 조직에 대한 개념으로 이어졌다. 냄새는 상대적으로 정확하게 케니언 세포의 드물게 활성화 앙상블에 의해 인코딩된다. 이러한 케니언 세포 앙상블의 일치 활성 및 도파민의 방출 – 자극을 처벌하여 불러일으킨 – 케년 세포 프리시냅스에서 MB 출력 뉴런으로의 전염을 조절하여 동물이 이후에 이 특정 한 냄새를 피할 수 있도록^{10 ,12}. 우리는 시냅스 활동에 있는 이 학습 의존적인 변경이 어떻게 결정되고 감시될 수 있는지 설명하기 위하여 패러다임 사례로 오히려 정확하게 정의되고 현지화된 engram를 이용합니다.

모델 시스템으로 Drosophila의 가치는 복잡한 회로¹⁸내의 단일 뉴런을 식별, 모니터링 및 제어하기 위한 트랜스유전자를 표현할 수 있는 타의 추종을 불허하는 유전 적 도구 상자에 강하게 의존합니다. 여기에서 논의된 칼슘 이미징과 같은 신경 활동 모니터링을 위한 기술의 출현은 특정 자극에 반응하여 신경 활동 패턴의 측정을 허용했습니다. 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs)의 특정 Gal4 구동 식과 후각 자극을 결합함으로써, 관심 있는 뉴런의 악취유발 칼슘 역학을 시각화할 수 있다^19. 이 프로토콜에서는 이 기술을 고전적인 컨디셔닝 패러다임과 추가로 결합함으로써 학습의 맥락에서 이러한 후각 반응을 검사할 수 있음을 보여준다. 학습 유도 가소성은 단일 특정 뉴런뿐만 아니라 뉴런의 특정 하위 구획에 국한되는 GECI를 사용하여 추가로 해부 될 수 있습니다. Pech 등²⁰ 정확히 이것을 허용하는 도구의 선택을 설립했다. GCaMP3^21을 척추동물 시냅토피신 또는 d호머에 대한 연계를 통해 사전 또는 후시냅스를 대상으로 함으로써, 각각^20-이들부위의 차등 변조를 구별할 수 있다. 이러한 국소화는 시토솔 전체에 걸쳐 유비쿼터스적으로 존재하는 대부분의 GEC에 비해 이점이 있습니다 -예를 들어, GCaMP^22,GCaMP3^21,또는 GCaMP6²³ – 사전 및 사후 내시 과도가 될 수 있음을 의미하기 때문에 신경 활성화의 결과로 발생하는 전반적인 통합 칼슘 유입과 구별됩니다. 이 결과 발생 하거나 학습 및 메모리 형성을 일으키는 원인이 되는 가소성의 위치와 종류에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 일례로, 여기에 제공된 프로토콜은 후각 연관 학습 동안 MB 출력 뉴런의 변조를 해독하는 데 있어서 이 도구의 가치를 나타낸다. 모니터링함으로써, 개별 비행 내에서, 후각 컨디셔닝 전후의 악취 유발 활동은 순진한 냄새 반응과 학습된 냄새 반응 사이에 직접적인 비교를 그릴 수 있습니다. 동일한 이미징 챔버에 고정되어 있는 동안 파리는 다양한 냄새에 노출됩니다. 그런 다음, 이러한 악취 중 하나가 감전과 짝을 이루는 비동기 연관 컨디셔닝프로토콜을 수신하고 (CS +가됨) 또 다른 냄새가 보강없이 제시됩니다^{(CS가됨 –}). 마지막으로, 파리는 첫 번째 단계에서와 같은 냄새에 다시 노출됩니다. 칼슘 역학은 2 광자 현미경 검사법을 사용하여 관찰됩니다.