Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Os astrocytes são as pilhas as mais abundantes no sistema nervoso central adulto, onde executam funções desenvolventes e homeostático originais¹. Os astrócitos modulam o desenvolvimento sináptico através do contato direto com terminais pré e pós-sinápticos como parte da sinapse Tri-partite, que contém receptores de neurotransmissores, transportadores e moléculas de adesão celular que facilitam a formação de sinapse e comunicação do Neuron-astrocyte². Além disso, os astrócitos controlam ativamente a transmissão sináptica e impedem a excitotoxicidade neuronal removendo rapidamente neurotransmissores excitatórios da fenda sináptica, reciclando neurotransmissores e participando da poda sináptica^{3 , 4. º , 5. º , 6}. para habilitar essas funções altamente interativas, os astrócitos se comunicam entre si, com outras células gliais, e com neurônios através de proteínas de membrana especializadas, incluindo moléculas de adesão celular, aquaporinas, canais iônicos, transportadores de neurotransmissores e moléculas de junção de Gap. Os astrocytes mudam ativamente os níveis de superfície destas proteínas em resposta às flutuações em seu ambiente intra e extracelular⁷. Além disso, mudanças nos níveis e na distribuição de mitocôndrias, gotículas lipídicas e organelas degradantes e recicladoras modulam o suprimento energético, a disponibilidade de metabolito e os processos de compensação celular que são essenciais para a função de astrocite e Sobrevivência.

As mudanças dinâmicas na proteína da membrana e no tráfico de organelas e posicionamento em astrócitos são facilitadas pela função concertada das proteínas motoras e dos adaptadores que promovem a motilidade de carga^8,9. Da mesma forma, os níveis superficiais das proteínas da membrana são modulados através de eventos de internalização e reciclagem¹⁰. Estas cargas são transportadas através de uma intrincada rede de actina, microtúbulos e, possivelmente, faixas de filamentos intermediários⁸. Os estudos baseados na coloração da imunofluorescência da proteína de ligação final 1 (EB1), que se acumula no microtubule mais extremidades crescentes, sugerem que nos astrócitos os feixes dos microtúbulos irradiam para fora do perinucleus e estenda sua extremidade mais para a periferia¹¹. Entretanto, uma examinação detalhada da organização e da polaridade dos microtúbulos e de outros elementos cytoesqueléticos usando a imagem latente da vivo-pilha é ainda falta. Embora muitos dos mecanismos subjacentes à dinâmica das organelas e das proteínas da membrana tenham sido extensivamente estudados em neurônios e outros tipos de células, a motilidade da carga nos astrócitos é menos bem compreendida. A maioria de nosso conhecimento atual sobre mudanças na distribuição da proteína e do organela nos astrócitos é baseada na rotulagem anticorpo-baseada tradicional da preparação fixa, que impede o exame espacial e temporal preciso da dinâmica de carga^{7, doze anos}.

Aqui, nós descrevemos um método para etiquetar proteínas e organelas da membrana para a imagem latente viva em culturas preliminares do astrocyte do rato da pureza elevada. Usando este protocolo, nós fornecemos exemplos em que nós rastreamos a localização dinâmica de proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetada proteínas de membrana em astrocytes transfected, incluindo a junção de Gap proteína conexina 43 (Cx43-GFP) e o aminoácido excitatória transportador 1 (EAAT1-GFP). Nós igualmente descrevemos o uso de uma ponta de prova acidotropic fluorescente para visualizar organelas ácidos e para seguir sua dinâmica do tráfico em astrocytes vivos. Finalmente, demonstramos como analisar os dados de lapso de tempo para extrair e avaliar os parâmetros de transporte para cargas individuais.