Summary

化学的アプローチによるストラタム角質のインビボ共焦点ラマンスペクトルからの水、タンパク質、脂質の解明

Published: September 26, 2019
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Summary

ここでは、スペクトル外れ値除去およびその後の主要特徴の抽出に対する化学的アプローチと組み合わせた臨床研究におけるヒト被験者からの共焦点ラマンスペクトルの収集のためのプロトコルを提示する。

Abstract

生体内共焦点ラマン分光法の開発により、ヒト被験者の深度分解能を持つ水、タンパク質、脂質の直接測定が可能になります。この情報は、皮膚関連疾患やスキンケア製品の性能を特徴付けるための非常に重要です。このプロトコルは、共焦点ラマンスペクトル収集の方法と、化学測定を利用したスペクトルデータセットのその後の分析を示す。この方法の目的は、データ収集の標準プロトコルを確立し、データ分析の一般的なガイダンスを提供することです。前処理(例えば、外れ値スペクトルの除去)は、臨床研究から大規模なデータセットを処理する際の重要なステップです。例として、データセットの事前知識に基づくガイダンスを提供し、外れ値の種類を特定し、それらを削除するための具体的な戦略を開発します。主成分解析が行われ、負荷スペクトルを参照材料からのスペクトルと比較し、最終的な多変量曲線分解能(MCR)解析で使用される成分の数を選択します。このアプローチは、大規模なスペクトル データセットから意味のある情報を抽出する場合に成功します。

Introduction

臨床研究では、生体内共焦点ラマン分光法において、角質層の厚さと水分含有量1、2、3、4決定し、その浸透を追跡する独自の能力を示している。皮膚5、6にトフェックに適用される活性材料。非侵襲的なアプローチとして、共焦点ラマン分光法は振動モードに基づいて分子信号を検出する。したがって、ラベリングは7を必要としません。インビボ共焦点ラマン分光法は、技術の共焦点性質に基づく深度分解能を有する化学情報を提供する。この深度依存性情報は、スキンケア製品4、8、老化9、10、季節変化3、ならびに皮膚バリア機能疾患の影響を研究する上で非常に有用であり、アトピー性皮膚炎11、12など。高周波ラマン分光法(2,500~4,000cm-1)には多くの情報があり、水は3,250~3,550cm-1の間に異なるピークを生み出します。しかし、約2,800~3,000cm-1の間に集中するタンパク質と脂質のラマンピークは、主にメチレン(-CH2-)とメチル(-CH3)グループ13から生成されるので、互いに重なりいます。.この重複した情報は、個々の分子種の相対的な量を得る際の技術的な課題を提示します。ピークフィッティング14、15および選択的ピーク位置12、16のアプローチは、この課題を解決するために使用されてきた。しかし、これらの単一ピークベースの方法では、同じ成分から複数のラマンピークが同時に変化するため、純粋な成分情報を抽出することは困難です17.我々の最近の出版物18では、純粋な成分情報を解明するためにMCRアプローチが提案された。このアプローチを用いて、生体内共焦点ラマン分光データセットの大きな3つの成分(水、タンパク質、脂質)を抽出した。

大規模な臨床研究の実行は、生体内分光データを収集する個人に要求することができます。場合によっては、スペクトルの取得には1日に何時間も稼働する機器が必要であり、研究は数週間または数ヶ月まで延長することができます。このような条件下では、分光アーティファクトのすべてのソースを特定、除外、および修正するための技術的専門知識を持たない機器オペレータによって分光データが生成される場合があります。結果のデータセットには、分析前にデータから識別および除外する必要がある分光外れ値のごく一部が含まれている場合があります。本論文では、MCRでデータを分析する前に、臨床ラマンデータセットを「クリーンアップ」するための化学測定分析プロセスを詳細に示す。外れ値を正常に除去するには、外れ値の種類と外れ値スペクトルの生成の潜在的な原因を特定する必要があります。次に、特定のアプローチを開発して、ターゲット外れ値を除去できます。これには、データ生成プロセスとスタディ設計に関する詳細な理解を含む、データセットに関する事前の知識が必要です。このデータセットでは、外れ値の大部分は低信号対雑音スペクトルであり、主に1)皮膚表面の上に収集されたスペクトル(30,862のうち6,208)、および2)蛍光室光からのスペクトルへの強い寄与(30,862点中67個)に起因する。皮膚表面の上に集められたスペクトルは、レーザー焦点が皮膚表面に近づき、主に皮膚の下の器械の窓にあるように、弱いラマン応答を生じる。蛍光室光からの強い寄与を持つスペクトルは、計器オペレータのエラーまたは被写体の動きによって生成され、共焦点ラマンコレクションウィンドウが被験者の身体部位によって完全に覆われない状態を生じる。これらのタイプのスペクトルアーティファクトは、データ取得時に分光専門家によるスペクトル獲得時に同定され、修復される可能性がありますが、この研究で使用された訓練を受けた計測器オペレータは、致命的な障害が観察されました。外れ値を識別して除外するタスクは、データ分析プロトコルに組み込まれます。提示されたプロトコルは、この課題を解決するために開発されています。皮膚表面の上の低信号対雑音スペクトルに対処するために、皮膚表面の位置を最初に決定し、皮膚表面の上に収集されたスペクトルの除去を可能にする必要があります。皮膚表面の位置は、補足図1に示すように、ラマンレーザー焦点が皮膚の半分と皮膚の半分である深さとして定義される。低信号対雑音スペクトルを除去した後、主成分分析(PCA)を実施し、蛍光室光ピークが支配する因子を抽出する。これらの外れ値は、対応する因子のスコア値に基づいて削除されます。

このプロトコルは、MCR プロセスで 6 つの主要コンポーネントを決定する方法の詳細情報を提供します。これは、PCA 解析の後に、異なる数の主成分で生成されたモデルの荷重間のスペクトル形状比較を行います。また、参考資料やヒト被験者のデータ収集の実験過程についても詳しく説明する。

Protocol

この研究は、1975年ヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに従って、北京小児病院の制度審査委員会によって承認されました。これは、良好な臨床実践のためのICHガイドラインに従って行われました。調査は2015年5月から7月にかけて行われた。 1. アトピー性皮膚炎を持つヒト被験者からの生体内共焦点ラマンスペクトルの採取 次の基準に従って被験者を含めます。<o…

Representative Results

本臨床研究では、生体内共焦点ラマンスペクトルを4~18歳の28人の被験者から採取した。上記のデータ収集プロトコルで合計30,862のラマンスペクトルが収集されました。この大きなスペクトル データセットには、図 4Aに示すように、20% のスペクトル外れ値が含まれています。低信号対ノイズ外れ光線スペクトルは、皮膚表面を決定した後に除去され、続いてPCAがルー?…

Discussion

プロトコルのセクション2および3で説明するように、データ収集中に、各深度プロファイルは、赤い円で強調表示された顕微鏡画像から暗い領域を見つけることによって、計器の窓と皮膚の間に接触する領域で収集されました。図 2C.これらの領域が見つかったら、データ解析手順のスキン サーフェスの位置を正確に決定するために、皮膚表面の上の深度プ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、企業機能分析およびパーソナルクレンジングケア部門からの財政的支援を大いに認めています。分析アソシエイト・ディレクターのジャスミン・ワン氏とロブ・ガードナー博士の指導と支援、そしてデータ収集に関する彼女の支援に対するLi Yang氏に感謝の意を表したいと思います。

Materials

Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich
Cholesterol Sigma-Aldrich
Cholesterol 3-sulfate sodium Sigma-Aldrich
D-Erythro-Dihydrosphingosine Sigma-Aldrich
DI water Purified with Milipore(18.2MΩ)
Gen2-SCA skin analyzer River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands Gen2
Matlab 2018b Mathwork 2018b
N-behenoyl-D-erythro-sphingosine Avanti Polar Lipids, Inc.
N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) Avanti Polar Lipids, Inc.
Oleic Acid Sigma-Aldrich
Palmitic Acid Sigma-Aldrich
Palmitoleic Acid Sigma-Aldrich
PLS_Toolbox version 8.2 Eigenvector Research Inc. 8.2
RiverICon River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands version 3.2
Squalene Sigma-Aldrich
Stearic Acid Sigma-Aldrich

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Zhang, L., Cambron, T., Niu, Y., Xu, Z., Su, N., Zheng, H., Wei, K., Ray, P. Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach. J. Vis. Exp. (151), e60186, doi:10.3791/60186 (2019).

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