Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Dieses Protokoll wurde gemäß den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Universität durchgeführt und sollte in Übereinstimmung mit den individuellen institutionellen Richtlinien durchgeführt werden. 1. Reagenz-Vorbereitung Für Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)/20% fetales Rinderserum (FBS), hohe Glukose DMEM mit Natriumpyruvat mit 20% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep), 1% L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 10-4-M 2- mischen Mercaptoethanol. Für vollständiges DMEM mit Natriumpyruvat mit 10% FBS, 1% Pen/Strep und 1% L-Glutamin mit natriumpyruvat mischen. Für hämatopoetisches Medium hämatopoetisches Medium (Materialtabelle) mit 10-6 M Hydrocortison und 1% Pen/Strep mischen. Verwenden Sie Phosphat-gepufferte Saline (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium. 2. Menschliche Dermale Fibroblasten-Isolierung HINWEIS: HDFs können bei zertifizierten Lieferanten(Materialtabelle)erworben werden. In diesem Fall können Fibroblasten erweitert und direkt in Umprogrammierungsexperimenten verwendet werden (Abschnitt 4). Alternativ können HDFs von Spendern isoliert werden. Wenn Fibroblasten von verschiedenen Spendern isoliert sind, halten Sie die Proben bei allen Schritten des Protokolls voneinander getrennt. Etikettenschilder/Brunnen und Sammelrohre mit der Identifikationsnummer jedes Spenders. Erhalten Sie HDFs von 3 mm runden Hautpunschbiopsien, die von qualifizierten Ärzten durchgeführt werden. Beschichten Sie drei Brunnen einer gewebekulturbehandelten 6-Well-Platte mit 500 l 0,1% Gelatine und inkubieren Sie 20 min bei 37 °C. Die verbleibende Gelatinelösung aspirieren und 750 L DMEM/20% FBS zu jedem Brunnen hinzufügen. Die gesamte Oberfläche des Brunnens sollte mit Medium bedeckt werden. 1,5 ml DMEM/20% FBS auf die Innenseite eines sterilen 100 mm Petrischalendeckels geben und den Tropfen mit Hilfe einer 5 ml serologischen Pipette verteilen. Legen Sie die Hautbiopsie im Medium mit sterilisierter Zange auf den Deckel. Sezieren Sie die Hautbiopsie in neun identische Abschnitte, mit einem sterilisierten Skalpell, um die Biopsie an Ort und Stelle zu halten und ein zweites Skalpell zu schneiden. Legen Sie drei Biopsiestücke pro Brunnen mit spitzen Zangen. Stellen Sie sicher, dass die Stücke an der Unterseite des Brunnens befestigt werden. Legen Sie einen 22 mm Deckelschlupf auf die Stücke und drücken Sie etwas Unterdruck. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5%CO2, für eine Woche. Überprüfen Sie die Zellen täglich und fügen Sie alle 2 Tage 200 L DMEM/20 % FBS hinzu, um das verdampfte Medium zu ersetzen. Nach einer Woche bis zu 2 ml DMEM/20% FBS addieren und Medium alle 2 bis 3 Tage ersetzen. Durchgangszellen im Verhältnis 1:4, wenn Brunnen konfluent sind (ca. 4-8 Wochen). Bereiten Sie 0,1% gelatinebeschichtete Gewebekultur-behandelte 6-Well-Platten vor. Absaugmedium aus Brunnen bei 80% Koninfluenza und einmal mit 1 ml PBS waschen. Entfernen Sie den Deckelrutsch mit steriler Zange und legen Sie den Deckelinin in einen neuen Brunnen einer 6-Well-Platte, mit der Gewebeseite nach oben.HINWEIS: Auch Zellen, die am Deckschein befestigt waren, werden geerntet. Fügen Sie 500 l Dissoziationslösung(Materialtabelle) pro Brunnen (einschließlich Brunnen mit den Abdeckungen) und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 für 5 x 10 min. Überprüfen Sie, wann Zellen beginnen, von der Unterseite des Brunnens zu steigen und inaktivieren Die Dissoziationslösung durch Zugabe von 500 l DMEM/20% FBS zu jedem Brunnen. Sammeln Sie Fibroblasten aus allen Brunnen in einem 15 ml konischen Rohr. Fügen Sie den Brunnen zusätzliches Medium hinzu, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min. In der Zwischenzeit fügen Sie jedem Brunnen von zuvor gelatinebeschichteten Platten 500 l DMEM/20% FBS hinzu. Aspirieren Sie Medium und resuspendieren Sie Fibroblasten in 6 ml DMEM/20% FBS. Fügen Sie jedem Brunnen 500 l Fibroblastsuspension hinzu (insgesamt zwei 6-Well-Platten pro Probe/Spender). Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 °C, 5%CO2. Am nächsten Tag 1 ml DMEM/20% FBS zu jedem Brunnen hinzufügen. Ersetzen Sie Medium durch 2 ml DMEM/20% FBS alle 2 bis 3 Tage, bis die Brunnen zu 80 % konfluent sind. Wiederholen Sie Abschnitt 2.11 für drei konfluente Brunnen, bis der dritte Durchgang erreicht ist. Einfrieren von Fibroblasten aus Konfluentbrunnen (Passagen 1 und 3). Medium aus den Brunnen aussaugen und einmal mit 1 ml PBS waschen. Dissoziieren und Sammeln von Fibroblasten, wie in den Schritten 2.11.4 und 2.11.5 beschrieben. Zählzellen mit einem Hämozytometer und Zentrifugieren sie das Rohr bei 350 x g für 5 min. Nach zentrifugieren, Aspirieren Medium und Resuspend Fibroblasten in FBS mit 10% DMSO bei einer Dichte von 5 x 105 Zellen/ml. 1 ml der Zellsuspension pro Kryovial und Gefrierzellen über Nacht bei -80 °C mit einem Gefrierbehälter hinzufügen. Bewegen Sie Fläschchen auf -150 °C (flüssiger Stickstoff) für die langfristige Lagerung. 3. Lentivirale Produktion Wachsen Sie HEK293T-Zellen in einer 100 mm Gewebekultur behandelten Schale mit 10 ml komplettem DMEM, bei 37 °C, 5%CO2, bis die Konfluenz erreicht ist. Am Tag vor der Transfektion, aspirieren Medium und waschen Sie die Schale sorgfältig mit 5 ml PBS. Nach dem Entfernen von PBS 1,5 ml Dissoziationslösung hinzufügen und bei 37 °C, 5%CO2 für 5 x 10 min inkubieren, um Zellen von der Schale zu trennen.HINWEIS: Es wird empfohlen, sowohl PBS als auch Dissoziationslösung vor der Verwendung zu erwärmen, damit die Zellen keinen thermischen Schock erleiden. Inaktivieren Sie die Dissoziationslösung mit 3 ml komplettem DMEM und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr. Waschen Sie die Schale mit 5 ml komplettem DMEM, um die verbleibenden angeschlossenen Zellen zu entfernen und dieses Volumen auf das 15 ml konische Rohr zu übertragen. Zentrifugenzellsuspension bei 350 x g für 5 min. Aspirieren Sie Überstand und teilen Sie das Zellpellet gleichmäßig zwischen sechs 100 mm Gewebekultur behandelten Gerichten in einem Endvolumen von 10 ml komplettem DMEM pro Schale. Die Zellen sollten zum Zeitpunkt der Transfektion etwa 60 % konfluent sein. Am nächsten Tag vermischen sich die transfekten Zellen mit dem Plasmid wie folgt:HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls beschreibt die Produktion von Lentiviren in einer 100 mm Gewebekultur-behandelten Schale pro Plasmidmischung. Um höhere Mengen an lentiviralem Überstand für die Konzentration zu erhalten, verwenden Sie mindestens vier 100 mm HEK293T Zellkulturschalen pro Mischung. In einem 15 ml konischen Röhrchen fügen Sie 10 g der drei Transferplasmide zusammen: 3,33 g pFUW-tetO-GATA2 (Addgene Plasmid #125028)14, 3,33 g pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 und 3,33 g pFUW-tetO-FOS (Addgene #125598)14, plus 10 g der2. Generation psPAX2 Verpackungsvektor codierung die Gag, Pol, Tat und Rev Gene (Addgene #12260) und 5 ‘g pMD2.G Hüllkurvenvektor Kodierung der VSV-G Gen (Addgene #12259). Fügen Sie Wasser bis zu 500 l hinzu. In zwei neuen 15 ml konischen Röhrchen fügen Sie 10 g FUW-M2rtTA-Plasmid (Addgene #20342)17, 10 g psPAX2-Verpackungsvektor und 5 g pMD2.G Hüllkurvenvektor zu jeder Röhre hinzu. Fügen Sie Wasser bis zu 500 l hinzu. Ein Rohr wird als Steuerung verwendet werden. Zu jedem Rohr 62,5 l von 2 M CaCl2hinzufügen. Lassen Sie als Nächstes Blasen in jede Mischung mit einer Pasteur Pipette los, die in einen Pipettenregler eingesetzt wird. Während sich Blasen bilden, pufferte Pipette 500 l N,N-Bis(2-Hydroxyethyl)-2-Aminoethanesulfonsäure (BES) salin (pH 7,1, 25 °C), mit einer P1000 Pipette, tropfenweise gegen die Pasteurpipetundundund und auf das Gemisch. Röhren bei Raumtemperatur für mindestens 15 min inkubieren. Die Mischungen werden nach einiger Zeit leicht bewölkt erscheinen. In der Zwischenzeit, Aspirieren Medium aus HEK293T Zellschalen (am Vortag durchgelassen) und fügen Sie 10 ml komplette DMEM ohne Antibiotika. Seien Sie vorsichtig und fügen Sie Medium langsam hinzu, da HEK293T-Zellen semi-adherent sind. Jede einzelne Mischung (ca. 1 ml) gleichmäßig und tropfenweise in getrennte Gerichte verteilen und über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Medium durch 4 ml komplette DMEM, 24 h nach inkubationszeit. Über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Wenn verfügbar, inkubieren Sie stattdessen bei 32 °C, 5%CO2, da die reduzierte Temperatur die Halbwertszeit der lentiviralen Partikel erhöht. Sammeln Sie Überstand mit lentiviralen Partikeln dreimal zu einem 50 ml konischen Rohr. Mischen Sie an dieser Stelle keine verschiedenen lentiviralen Partikel. Jedes Gericht führt zu 12 ml Lentiviralüberstand. Vier Gerichte der gleichen viralen Zubereitung passen in eine 50 ml konische Röhre.VORSICHT: Führen Sie die lentivirale Sammlung in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 in einer laminaren Durchflusshaube für lentivirale Arbeit durch und legen Sie viral kontaminierte Abfälle (Rohre, Spitzen, Geschirr) in einen geeigneten Behälter für biogefährliche Materialien. Führen Sie die erste Sammlung 16 h nach der letzten Inkubation durch und fügen Sie 4 ml vollständiges DMEM hinzu. Inkubieren bei 37 °C, 5%CO2. Nehmen Sie die zweite Sammlung 8 h nach der ersten auf das gleiche Rohr, fügen Sie 4 ml komplette DMEM und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2. Machen Sie die dritte Sammlung 16 h nach der zweiten auf die gleiche Röhre und entsorgen Sie die Gerichte.HINWEIS: Lentivirale Überstoffe nach jeder Entnahme bei 4 °C lagern. Filtern Sie jeden lentiviralen Überstand mit einem 0,45 m-Protein-Bindungsfilter mit einer Celluloseacetatmembran (Materialtabelle) zu einem sauberen Rohr. Fügen Sie maximal 15 ml gefilterten Überstand zu einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer regenerierten Zellulosemembran (Materialtabelle)hinzu und drehen Sie bei 4.000 x g für 25 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Durchfluss. Eine viskose Flüssigkeit, die Lentiviren enthält, verbleibt in der Filtereinheit. Wiederholen Sie Schritt 3.13, indem Sie 15 ml Überstand auf der Oberseite der Filtereinheit hinzufügen, bis kein lentiviraler Überstand mehr vorhanden ist.HINWEIS: Wenn es nur wenige Milliliter Überstand zu konzentrieren, verringern Sie die Spinnzeit auf 10 min. Wenn sich noch zusätzliche Flüssigkeit (nicht viskos) am Filter befindet, zentrifugieren Sie für weitere 10 min. Machen Sie Aliquots (50 bis 200 L je nach anfänglichem Überstandvolumen) jeder Art von konzentrierten Lentiviren und lagern Sie bei -80 °C für die Langzeitlagerung (1 bis 2 Jahre) oder bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung (1 bis 2 Wochen).HINWEIS: Konzentrierte oder nicht konzentrierte Lentiviren können auch frisch eingesetzt werden. Nicht wieder einfrieren und auftauen, da dies zu einem reduzierten Titer führt. 4. Hämogene Neuprogrammierung HINWEIS: Verwenden Sie HDFs mit einer Durchgangszahl von drei (P3) oder höher (bis P10), um Neuprogrammierungsexperimente durchzuführen. Eine 100 mm Gewebekultur behandelte Schale mit 5 ml 0,1% Gelatine beschichten und 20 min bei 37 °C inkubieren. Die verbleibende Gelatinelösung ansaugen. Eine Fibroblasten-Durchstechflasche und Plattenzellen in der 0,1% gelatinebeschichteten Schale auftauen. Über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Bei Bedarf Fibroblasten über einen längeren Zeitraum ausdehnen, bis der gewünschte Durchgang und die Einmündung erreicht sind. Beschichten Sie eine 6-Well-Gewebekultur-behandelte Platte mit 500 l 0,1% Gelatinelösung und inkubieren Sie bei 37 °C für 20 min. Entfernen Sie zusätzliche Gelatine. Platten-HDFs mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Platte (25.000 Zellen pro Bohrkörper) in 2 ml vollständiger DMEM pro Brunnen. Über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubieren, um eine Zellanhaftung zu ermöglichen. Ersetzen Sie Medium durch 2 ml komplettes DMEM plus 8 g/ml Polybren. Bereiten Sie einen 1:1-Verhältnismix aus poolproduzierten TF-Lentiviren und M2rtTA in einem neuen Mikrozentrifugenrohr vor.HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Pool-Produktion von Lentiviren für die drei TFs durchgeführt, was in den Händen der Autoren zu einer höheren Reprogrammierungseffizienz führt. Alternativ wird vorgeschlagen, eine Titration der einzelnen lentiviralen Partikel durch qPCR18an einer Standardzelllinie durchzuführen. Dies wird verwendet, um das Volumen der einzelnen Viren zu definieren, die notwendig sind, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) zu erfüllen, die für die Kotransduktion und hämogene Reprogrammierung optimal sind. Verteilen Sie 10 bis 100 L Lentiviral-Mischung pro Brunnen, um HDFs zu transducen. Dies ist Tag -2 der Neuprogrammierung.HINWEIS: Die Definition des optimalen Volumens des lentiviralen Mixes für eine effiziente Neuprogrammierung, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen, erfordert eine Optimierung (weitere Einzelheiten siehe Ergänzende Abbildung 1). HDFs mit mehr als 7 Durchgängen können höhere Virenmengen erfordern als Zellen mit niedrigeren Durchgängen. Entfernen Sie nach 16 h Inkubation Viren und fügen Sie vollständiges DMEM hinzu. Lassen Sie Zellen für 6 x 8 h wiederherstellen. Nach der Wiederherstellung, Aspirieren Medium und fügen Sie 2 ml komplette DMEM mit 8 g/ml Polybren. Führen Sie eine zweite Transduktion, wie in Schritt 4.6 beschrieben, und brüten Sie bei 37 °C, 5%CO2 für 16 h. Dies ist Tag -1 der Neuprogrammierung. Die lentivirale Mischung kann am Tag -2 für beide Transduktionen vorbereitet und bei 4 °C gehalten werden. Entfernen Sie am nächsten Tag die Viren und fügen Sie komplettes DMEM hinzu, das mit 1 g/ml DOX ergänzt wird. Dies ist Tag 0 der Neuprogrammierung. Bei 37 °C inkubieren, 5%CO2 für 48 h. Am Tag 2 der Neuprogrammierung, teilen Sie jeden Brunnen bei 1:2 Verhältnis. Aspirieren von Medium- und Waschzellen mit 1 ml PBS. Aspirieren Sie PBS und dissoziieren Sie Zellen mit 500 L Dissoziationslösung. Inkubieren Sie 5 bis 10 min bei 37 °C, 5%CO2. Inaktivieren Sie die Dissoziationslösung mit 1 ml komplettem DMEM und sammeln Sie Zellen in einem konischen Rohr. Zentrifuge bei 350 x g für 5 min. Setzen Sie das Pellet in hämatopoetischem Medium (siehe Schritt 1.3), ergänzt durch 1 g/ml DOX, und Plattenzellen in neue gewebekulturbehandelte 6-Well-Platten, die mit 0,1% Gelatine mit einem Endvolumen von 2 ml pro Brunnen beschichtet sind. Wechselmedium (hämatopoetisches Medium plus DOX) zweimal pro Woche für die Dauer der Umprogrammierungskulturen (25 Tage). Analysieren Sie die resultierenden neu programmierten Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie (siehe Ergänzende Abbildung 2), Durchflusszytometrie, Massen- und einzellige RNA-Sequenzierung und Transplantationstests zur Erfassung von hämatopoetische Morphologie, Vorhandensein von endothelialeund hematopoetischen Markern, Erfassung des endotheliaalen/hämatopoetischen Genexpressionsprofils und Regenerationsfähigkeit14. 5. Optimierung der Fibroblastenerweiterung für die ChIP-seq-Analyse beim Beginn der hämogenEn Reprogrammierung Platte 300.000 HDFs (<P8) in 0,1% gelatinebeschichtetem Gewebe kulturbehandelte 6-Well-Platten mit vollständiger DMEM bis zu einem Endvolumen von 2 ml pro Brunnen. Über Nacht bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag Medium durch vollständiges DMEM, ergänzt durch 8 g/ml Polybren. Transduce Zellen mit individuellen Faktoren: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 und pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 oder mit einem Pool der drei Faktoren, plus FUW-M2rtTA bei 1:1 Verhältnis. Verwenden Sie 10 x 20 L Gesamtvirus (individuelle TF + M2rtTA oder drei TFs + M2rtTA). Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 °C, 5%CO2.HINWEIS: Es wird empfohlen, zwölf 6-Well-Platten pro Zustand zu verwenden (für jeden einzelnen TF und die drei TFs kombiniert). Entfernen Sie lentiviren und fügen Sie komplette DMEM 16 h nach der ersten Transduktion hinzu. Lassen Sie Zellen für 6 x 8 h wiederherstellen. Transduce Zellen ein zweites Mal mit der gleichen Menge an Virus pro Zustand und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2. Entfernen Sie am nächsten Tag Viren und fügen Sie vollständiges DMEM hinzu. Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für 24 h. Proplatte jeweils gut in eine 0,1% gelatinebeschichtete, mit Gewebekultur behandelte 100-mm-Schale mit vollständiger DMEM bis zu einem Endvolumen von 10 ml pro Schale. Dies entspricht ungefähr einer 1:6-Passage. Lassen Sie Zellen 6 Tage bei 37 °C, 5%CO2wachsen. Am 6. Tag nach dem Erneutbeschichten, Aspirieren Medium und fügen Sie komplette DMEM mit 1 g/mL DOX. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C, 5%CO2 für 2 Tage. Sammeln Sie Fibroblasten und analysieren Sie genomische Bindungsstellen der drei TFs, die einzeln oder in Kombination durch ChIP-seq 2 Tage nach DOX-Supplementierung14transduziert wurden.HINWEIS: Die letzten zweiundsiebzig 100 mm Schalen enthalten zwischen 20 x 50 x 106 Zellen, ausreichend, um ChIP-seq-Experimente durchzuführen und zu replizieren.