Summary

Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

La enfermedad de injerto contra huésped es una complicación importante después del trasplante alogénico de médula ósea. Las células dendríticas desempeñan un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad del injerto contra el huésped. El artículo actual describe una nueva plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped y el efecto injerto-contra-leucemia.

Abstract

El trasplante alogénico de médula ósea (BMT) es una terapia eficaz para neoplasias malignas hematológicas debido al efecto injerto-contra leucemia (GVL) para erradicar los tumores. Sin embargo, su aplicación está limitada por el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), una complicación importante de la MtB. La EICH se evoca cuando las células T en los injertos de donantes reconocen el clorótatógeno expresado por las células receptoras y montan ataques inmunológicos no deseados contra tejidos sanos receptores. Por lo tanto, las terapias tradicionales están diseñadas para suprimir la aleeactividad de las células T del donante. Sin embargo, estos enfoques perjudican sustancialmente el efecto GVL para que no se mejore la supervivencia del receptor. Por lo tanto, es esencial comprender los efectos de los enfoques terapéuticos en bMT, GVL y EICH. Debido a las capacidades de presentación de antígenos y secretodenia para estimular las células T del donante, las células dendríticas receptoras (CC) desempeñan un papel importante en la inducción de la EICH. Por lo tanto, la segmentación de los controladores de datos de los destinatarios se convierte en un enfoque potencial para controlar la EICH. Este trabajo proporciona una descripción de una nueva plataforma BMT para investigar cómo los cAños anfitriones regulan las respuestas de GVH y GVL después del trasplante. También se presenta un modelo BMT eficaz para estudiar la biología de la EICH y la EV después del trasplante.

Introduction

El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (BMT) es una terapia eficaz para tratar las neoplasias malignas hematológicas1,2 a través del efecto injerto-contra-leucemia (GVL)3. Sin embargo, los linfocitos de donantes siempre montan ataques inmunológicos no deseados contra los tejidos receptores, un proceso llamado enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD)4.

Los modelos murinos de La EICH son una herramienta eficaz para estudiar la biología de la EICH y la respuesta GVL5. Los ratones son un modelo animal de investigación rentable. Son pequeñas y eficientemente dosificados con moléculas y productos biológicos en las primeras fases del desarrollo6. Los ratones son animales de investigación ideales para estudios de manipulación genética porque están genéticamente bien definidos, lo que es ideal para el estudio de vías y mecanismos biológicos6. Se han establecido bien varios modelos de GHC de MHC de complejos de histocompatibilidad (MHC) de ratón, como C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) y FVB (H2q) , C57BL/6 (H2b)5,7. Estos son modelos particularmente valiosos para determinar el papel de los tipos de células individuales, genes y factores que afectan a la EICH. El trasplante de C57/BL/6 (H2b) a receptores con mutaciones en MHC I (B6.C-H2bm1)y/o MHC II (B6.C-H2bm12) reveló que un desajuste tanto en MHC clase I como en clase II es un requisito importante para el desarrollo de la EICH aguda. Esto sugiere que tanto CD4+ como CD8+ T-células son necesarias para el desarrollo de la enfermedad7,8. La EICH también participa en una cascada inflamatoria conocida como la «tormenta proinflamatoria de la citoquina»9. El método de acondicionamiento más común en los modelos murinos es la irradiación corporal total (TBI) por rayos X o 137Cs. Esto conduce a la ablación de la médula ósea del receptor, permitiendo así el injerto de células madre del donante y previniendo el rechazo del injerto. Esto se hace limitando la proliferación de células T receptoras en respuesta a las células donantes. Además, las disparidades genéticas desempeñan un papel importante en la inducción de la enfermedad, que también depende del menor de coincidencia de MHC10. Por lo tanto, la dosis de irradiación mieloablativa varía en diferentes cepas de ratón (por ejemplo, BALB/c-C57BL/6).

La activación de las células T del donante por las células que presentan el antígeno host (ACC) es esencial para el desarrollo de la EICH. Entre los ACC, las células dendríticas (CC) son las más potentes. Son herediblemente capaces de inducir la EICH debido a su ingesta superior de antígenos, la expresión de moléculas coestimulantes de células T y la producción de citoquinas proinflamatorias que polarizan las células T en subconjuntos patógenos. Los CI receptores son fundamentales para facilitar el cebado de células T y la inducción de la EICH después del trasplante11,12. En consecuencia, los centros de interesado se han convertido en objetivos interesantes en el tratamiento de la EICH12.

Se requiere TBI para mejorar el injerto de células del donante. Debido al efecto TBI, los cocones receptores se activan y sobreviven durante un breve periodo de tiempo después del trasplante12. A pesar de los importantes avances en el uso de la bioluminiscencia o la fluorescencia, el establecimiento de un modelo eficaz para estudiar el papel de los DC receptores en la EICH sigue siendo un desafío.

Debido a que las células T del donante son la fuerza motriz para la actividad de GVL, las estrategias de tratamiento que utilizan medicamentos inmunosupresores como los esteroides para suprimir la aoresación de células T a menudo causan recaída tumoral o infección13. Por lo tanto, los dispositivos de compra de beneficiarios pueden proporcionar un enfoque alternativo para tratar la EICH, preservando al mismo tiempo el efecto GVL y evitando la infección.

En resumen, el estudio actual proporciona una plataforma para comprender cómo los diferentes tipos de señalización en los CC receptores regulan el desarrollo de la EICH y el efecto GVL después de BMT.

Protocol

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida Central. 1. Inducción de la EICH NOTA: El trasplante de células alogénicos de médula ósea (BM) (paso 1.2) se realiza dentro de las 24 h después de la irradiación. Todos los procedimientos descritos a continuación se realizan en un entorno estéril. Realice el procedimiento en una campana de cultivo de tejido y utilice reacti…

Representative Results

El principal modelo B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) correspondió estrechamente al desarrollo de la EICH después del trasplante(Figura 2). Los seis signos clínicos de la EICH establecidos anteriormente por Cooke et al.16 ocurrieron en los receptores trasplantados con células T WT-B6, pero no en los receptores trasplantados solo con BM (paso 1.5), que representaba el grupo negativo de la EICH. Hay dos fases en el desarr…

Discussion

El uso de células madre para adaptarse a un individuo en particular es un enfoque eficaz para tratar cánceres avanzados y resistentes18. Los productos farmacéuticos de moléculas pequeñas, sin embargo, han permanecido durante mucho tiempo un foco principal de la terapia personalizada contra el cáncer. Por otro lado, en la terapia celular una multitud de interacciones entre el donante y el huésped puede influir decisivamente en los resultados del tratamiento, como el desarrollo de la EICH des…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio es apoyado por la beca de inicio de la Universidad de Florida Central College of Medicine (a HN), la beca de inicio del Centro de Cáncer Hillman de la Universidad de Pittsburgh, Hillman Cancer Center (a HL), la Subvención NIH de los Estados Unidos #1P20CA210300-01 y la Beca del Ministerio de Salud de Vietnam #4694/QD-BYT (a PTH). Agradecemos al Dr. Xue-zhong Yu de la Universidad Médica de Carolina del Sur por proporcionar materiales para el estudio.

Materials

0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T., Alvarez, A. M., Le, N., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

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