Summary

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

Published: August 17, 2019
doi:

Summary

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

Abstract

האנזימים atpase לנצל את האנרגיה החופשית מאוחסן אדנוזין טריפוספט כדי לזרז מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים מאנדריוני ב vivo זה לא היה מתרחש באופן ספונטני. חלבונים אלה חיוניים למעשה כל ההיבטים של החיים הסלולריים, כולל חילוף החומרים, החטיבה התא, תגובות שינויים סביבתיים ותנועה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הסביבה הזאת באמצעות הקרנת מולקולות של מולקולה קטנה (NADH) בשילוב של מולקולת התפוקה למחצה. הדבר הוחל על שריר לב השלד רירן II של, שני actin מבוססי מנוע מולקולרי ATPases, כהוכחה לעיקרון. ההידרוליזה של ATP משולב לחמצון של NADH על ידי תגובות אנזימטיות בבחינה. ראשית, ה-ADP שנוצר על-ידי ה-ATPase נוצר מחדש ל-ATP על ידי פירובט קינאז (PK). PK מזרז את המעבר של פוספולרופפירובט (פפ) לפירובט במקביל. לאחר מכן, פירובט מצטמצם לקטט על ידי לקטט דהידרוגנאז (LDH), אשר מזרז את החמצון של NADH במקביל. לפיכך, הירידה בריכוז ה-ATP מכוונת ישירות לירידה בריכוז NADH, הבאה לאחר שינוי בזריחה הפנימית של NADH. כל עוד מערכת ה-פפ זמינה במערכת התגובה, ריכוז ה-ADP נותר נמוך מאוד, ונמנע מעיכוב באנזים ATPase באמצעות מוצר משלו. יתרה מזאת, הריכוז של ATP נשאר כמעט קבוע ומניב קורסי זמן ליניאריים. הזריחה מנוטרת ברציפות, אשר מאפשר הערכה קלה של איכות הנתונים ומסייע לסנן חפצים פוטנציאליים (למשל, הנובעים משקעים מורכבים או שינויים תרמיים).

Introduction

מיוחטאים הם מכניכי אנרגיה מכימיים הידרוליייז אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי ליצור תנועה כיוונית לאורך החוטים של השלד של אקטין ב eukaryotes1,2. יש להם הן מבנית ומותאם באופן מבחינה מדומה פונקציות תאיים שונות שלהם, כגון התחבורה של אורגלים, התכווצות שרירים או את הדור של מתח ציטושלד1,2. רירן משפחה מיוצגת על ידי ~ 40 רירן גנים השייכים ~ 12 מחלקות רירן נפרדות בגנום האדם3,4. חברי הכיתות רירן לשחק תפקידים שונים בקבוצה מגוונת מאוד של הפרעות, כגון מספר סוגי סרטן, הפרעות נוירולוגיות, השלד myopathies, ו יפרטרופית שריר הלב5,6. בהתחשב במספר הגדול של התפקודים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של המנועים המולקולריים הללו, אין זה מפתיע שהם נעשים יותר ויותר מוכרים כמטרות סמים עבור מגוון של תנאים7. התקדמות משמעותית נעשתה לאחרונה בגילוי של מעכבי רירן חדשים8,9,10 ומפעילים11, כדי לשפר את המאפיינים של הקיימים12, מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , . חמש עשרה

המלון הינו בשילוב עם השימוש באותו מספר שימש למדידת פעילות ה-ATPase באנזימים שונים, כגון הsarcoplasmic הרשת2 + משאבת atpase16, תיקון DNA atpase Rad5417, AAA + ATPase p9718 או מנוע מיקרוכדורית19. התהליך מעסיק מעגל התחדשות של ATP. אדנוזין diphosphate (ADP) שנוצר על ידי ATPase הוא נוצר מחדש ל-ATP על ידי פירובט קינאז (PK), אשר הופך מולקולה אחת של פוספולרופפירופיבט (פפ) לפירובט במקביל. לאחר מכן, פירובט מופחת כדי לקטט ידי לקטט דהידרוגנאז (LDH). זה, בתורו, מחמצן אחד מולקולה של NADH ל-NAD. לפיכך, הירידה בריכוז NADH כפונקציה של זמן שווה לקצב ההידרוליזה של ATP. מחזור ה-ATP שומר על ריכוז ה-ATP כמעט קבוע והריכוז של ADP מועט כל עוד האפשרות של ה-פפ זמינה. התוצאה היא קורסי זמן ליניארי, מה שהופך אותו פשוט כדי לקבוע את שיעורי התגובה הראשונית ומסייע להימנע מעיכוב המוצר על ידי ADP19. למרות הדרישה NADH מצמידים ATPase כבר הותאם 96-היטב בפורמט20, התגובה הגבוהה ביותר (~ 150 μl) לעשות את זה יקר יחסית בשל הביקוש הגבוה של ריאגנטים, עיבוד זה קל פחות להקרנה מהירה של מספרים גדולים של תרכובות. שיטות אלטרנטיביות, כגון השיטה הירוקה למלאכית19,21, המסתמכת על גילוי הפוספט המיוצר על ידי האנזים atpase, הוכחו מתאימים יותר למזעור ולהקרנה בתפוקה גבוהה22 , מיכל בן 23 , 24. עם זאת, שיטת נקודות קצה עשויה להיות מושפעת ממספר פריטים (שנדונו להלן), שעלולים להישאר לא מתקיימים בהיעדר קורסים במשרה מלאה.

כאן, הבקשה NADH ביחד ATPase ממוטבת עבור הקרנת תפוקה למחצה גבוהה של מעכבי מולקולה קטנה. שריר השלד ושרירי הלב רירן II ו רירן מעכבי בלייבסטטין8, פארא-האמיביוסטטין11 ו פארא-ניטרוגליצרין בליביוסטטין12 משמשים כדי להדגים את כוחה של היכולת, אשר נשענת על nadh פלואורסצנטית כבדיקה. פרוטוקול זה הוא קל לסינון פרויקטים התמקדו כל הפקת האנזימים.

Protocol

1. הכנת פתרונות מניות וריאגנטים להכין את הפתרון המלאי (DTT) מניות על ידי המסת DTT גבישי במים מזוקקים לריכוז הסופי של 1000 מ”מ. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c. הכנת פתרון מניות ATP על ידי המסת ATP גבישי במים מזוקקים לריכוז הסופי של 100 מ”מ. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 …

Representative Results

המפה האופיינית לפריסת הלוח המשמשת לסינון ניסויים מוצגת באיור 1. השורות הראשונות והאחרונות שמורות עבור כיול NADH ושליטה חיובית (20 μM פארא-האמיבלביוסטטין, 0.5% dmso), בהתאמה. השורות הנותרות (ב-O) משמשות לבדיקת פעילות העכבות של תרכובות. כאן, 15-צעד סדרתי 1:2 לדילול …

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול

למטב את פריסת צלחת על ידי הפעלת כמה צלחות עם שליטה שלילית בלבד (התגובה ATPase ללא מעכב). בדוק את התוצאות בקפידה עבור דפוסים בשיעורי התגובה. לדוגמה, אלה עשויים לנבוע מאפקטי קצה ו/או פגמים בציפוי המשטח של הידרופיפילית של צלחות “לא מחייבות”. אם תבני?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ המכון הלאומי על התעללות בסמים NS096833 (CAM).

Materials

384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

Riferimenti

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3′-hydroxyblebbistatin and (S)-3′-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?. Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).

Play Video

Citazione di questo articolo
Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

View Video