Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes
Summary
We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.
Abstract
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om nieuwe membraan transporteurs functioneel te karakteriseren. Polyamines zijn alomtegenwoordig in alle organismen, maar polyamine-wisselaars in planten zijn niet geïdentificeerd. Hier schetsen we een methode om polyamine-antiporters te karakteriseren met behulp van membraan blaasjes gegenereerd uit de lysis van Escherichia coli cellen die heterologously een plant antiporter uitdrukken. Eerste, we heterologously uitgedrukt AtBAT1 in een E. coli stam tekort aan polyamine en arginine Exchange transporters. Blaasjes werden geproduceerd met behulp van een Franse pers, gezuiverd door ultracentrifugatie en gebruikt in een membraanfiltratie test van gelabelde substraten om de substraat specificiteit van de transporter aan te tonen. Deze assays aangetoond dat AtBAT1 is een proton-gemedieerde transporter van arginine, γ-aminoboterzuur (GABA), putrestsin en spermidine. De Mutante stam die werd ontwikkeld voor de bepaling van AtBAT1 kan nuttig zijn voor de functionele analyse van andere families van plantaardige en dierlijke polyamine wissel wisselaars. We veronderstellen ook dat deze aanpak kan worden gebruikt om te karakteriseren vele andere soorten anti porters, zolang deze eiwitten kunnen worden uitgedrukt in de bacteriële celmembraan. E. coli is een goed systeem voor de karakterisering van nieuwe transporteurs, omdat er meerdere methoden zijn die kunnen worden gebruikt om inheemse vervoerders te mutageen.
Introduction
Eiwitten die betrokken zijn bij de handel in metabolieten vormen een essentieel niveau van fysiologische regulering, maar de overgrote meerderheid van de planten membraan vervoerders is nog niet functioneel gekenmerkt. Er zijn verschillende strategieën geïmplementeerd om nieuwe transporteiwitten te karakteriseren. Heterologeuze expressie in model organismen zoals E. coli en eukaryote cellen zoals gist, Xenopus oocyten, zoogdiercellen, insecten cellen en plantencellen zijn allemaal gebruikt om hun transportactiviteit te bepalen1. Eukaryote cellen zijn begunstigd voor de uitdrukking van eukaryotische eiwitten, omdat de basis cellulaire samenstelling, signaal transducing trajecten, transcriptie-en vertaal machines compatibel zijn met de inheemse omstandigheden.
Gist is een belangrijk modelorganisme voor de karakterisering van nieuwe transporteiwitten in planten. Het eerste plantaardige transporteiwit dat met succes werd uitgedrukt in gist (Saccharomyces pombe) was de van transporter HUP1 van Chlorella2. Sindsdien zijn veel planten transporteiwitten functioneel gekarakteriseerd met behulp van een gist uitdrukkings systeem. Deze omvatten, plantaardige suiker transporters (SUC1 en SUC23, VfSUT1 en VfSTP14) en de AUXIN SURGERY TRANSPORTERS (AUX1 en pin5). Nadelen van het gebruik van gist om plantaardige eiwitten te uiten kunnen een verminderde activiteit van Plastide-gelokaliseerde eiwitten omvatten, omdat gist deze organel mist, mistargeting6, en de vorming van misgevouwen aggregaten en activering van stress reacties in gist als gevolg van overexpressie van membraan eiwitten7,8,9.
Heterologeuze expressie van transporteiwitten in Xenopus -oocyten is op grote schaal gebruikt voor de elektrofysiologische karakterisering van transporters10. De eerste plantaardige transporteiwitten die worden gekenmerkt door heterologeuze expressie in Xenopus -eicellen waren het Arabidopsis kalium kanaal KAT110 en de Arabidopsis van transporter STP111. Sindsdien worden Xenopus -oocyten gebruikt om veel plantaardige transporteiwitten te karakteriseren, zoals plasma membraan transporters12, vacuole sucrose Transporter SUT413 en vacuole malaat Transporter ALMT914. Een belangrijke beperking van Xenopus -eicellen voor transport testen is dat de concentratie van intracellulaire metabolieten niet kan worden gemanipuleerd1. Bovendien is professionele kennis vereist om Xenopus -eicellen voor te bereiden en de variabiliteit van de oöcyten batches is moeilijk te beheersen.
Heterologeuze expressie in het modelorganisme E. coli is een ideaal systeem in termen van de karakterisering van nieuwe plantaardige transporteiwitten. Met een volledig gesequentieerde genoom15zijn de moleculaire en fysiologische kenmerken van E. coli bekend. Moleculaire gereedschappen en technieken zijn goed vastgesteld16. Daarnaast zijn er verschillende expressie vectoren, niet-pathogene stammen en mutanten beschikbaar17,18,19. Bovendien, E. coli heeft een hoge groeisnelheid en kan gemakkelijk worden geteeld onder laboratoriumomstandigheden. Veel eiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt en gezuiverd in hoge hoeveelheden in E. coli9. Wanneer eiwitten niet direct in cellulaire systemen kunnen worden getest, is reconstitutie van eiwitten in liposomen ook een succesvolle, zij het uitdagende innovatie voor de karakterisering van gezuiverde membraan eiwitten. Functionele karakterisering van de plant mitochondriale transporteiwitten met inbegrip van opgeloste transporters zoals fosfaat transporteurs in soja, maïs, rijst en Arabidopsis, dicarboxylaat-tricarboxylaatdrager in Arabidopsis zijn bereikt met behulp van dit modelsysteem20,21. Echter, recombinante eiwitten van de tomaten proteïne SICAT9 bleken niet functioneel te zijn in reconstitutie experimenten, en andere leden van de CAT Transporter familie bleken niet functioneel te zijn in Xenopus oöcyt assays22. Er zijn dus extra moleculaire gereedschappen nodig voor de karakterisering van membraan transporteurs.
Vijf polyamine transportsystemen zijn te vinden in E. coli23. Ze omvatten twee ABC-transporters die de opname van spermidinerijk en putrestsin, een putrestsin/Ornithine-wisselaar, een cadaverine/lysine-wisselaar, een spermidinerijk-exporteur en een importeur van putrestsin bemiddelen. De putrestsin wisselaar Pote werd oorspronkelijk gekarakteriseerd met behulp van een blaasje Assay, waarbij binnenstevoren blaasjes werden bereid door lyserende cellen met een Franse pers en het meten van de opname van van putrestsin in de blaasjes in ruil voor Ornithine24. Vesicle assays werden ook gebruikt om een calcium transporter te karakteriseren, die het transport van calcium in reactie op een proton gradiënt25bemiddelde. Deze experimenten hebben ons ertoe aangezet een strategie te ontwikkelen voor de karakterisering van andere polyamine wissel wisselaars. We eerst creëerde een stam van E. coli tekort in Pote en CADB wissel wisselaars. Hier demonstreren we de functionele karakterisering van een plantaardige polyamine antiporter door heterlogous expressie in de gemodificeerde E. coli stam, generatie van membraan blaasjes met behulp van een Franse pers, en van assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de huidige studie schetsen we een methode voor de karakterisering van een antiporter door eerst het eiwit in E. coli uit te drukken en vervolgens membraan blaasjes te genereren, zodat het heterologously uitgedrukte eiwit kan worden getest in een cel-vrij systeem. Naast de apparatuur die in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie wordt aangetroffen, vereist deze strategie het gebruik van een Franse pers, een ultracentrifuge, en toegang tot een faciliteit voor het uitvoeren van radio-isotopen testen.</p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteuning voor dit project kwam van de BGSU Graduate College, en de BGSU Office van gesponsorde Programma’s en onderzoek.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
Riferimenti
- Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
- Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
- Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker’s yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
- Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
- Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
- Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
- Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
- Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
- Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
- Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
- Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
- Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
- Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
- Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
- Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
- Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
- Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
- Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
- . P1vir phage transduction Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011)
- . pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010)
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
- . GaphPad Software Available from: https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019)
- Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
- Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
- Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
- Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
- Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
- Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
- LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
- Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
- Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
