Summary

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Published: August 16, 2019
doi:

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von antigenspezifischen CD8-T-Zellen und deren Ausdehnung in vitro mit dem Ziel, eine hohe Anzahl funktioneller T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo zu liefern.

Abstract

Typ-1-Diabetes (T1D) zeichnet sich durch eine isletspezifische Autoimmunität aus, die zur Betazellzerstörung und zum absoluten Verlust der Insulinproduktion führt. Im spontanen nicht-fettleibigen Diabetes -Mausmodell ist Insulin das primäre Ziel, und die genetische Manipulation dieser Tiere zur Entfernung eines einzigen Schlüsselinsulinepitops verhindert Krankheiten. Daher ist die selektive Eliminierung professioneller Antigen-präsentierender Zellen (APCs), die dieses pathogene Epitop tragen, ein Ansatz, um die unerwünschten insulinspezifischen Autoimmunreaktionen zu hemmen, und hat wahrscheinlich ein größeres translationales Potenzial.

Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) können T-Zellen selektiv auf krankheitserregende Antigene umleiten. Diese Technik ist von grundlegender Bedeutung für die jüngsten Versuche, Zelltechnik für die Adoptivzelltherapie zur Behandlung mehrerer Krebsarten zu verwenden. In diesem Protokoll beschreiben wir ein optimiertes T-Zell-Retrovirus (RV)-Transduktions- und In-vitro-Erweiterungsprotokoll, das eine hohe Anzahl funktioneller antigenspezifischer CD8-CAR-T-Zellen aus einer geringen Anzahl naiver Zellen erzeugt. Zuvor wurden mehrere CAR-T-Zellprotokolle beschrieben, in der Regel jedoch mit relativ geringer Transduktionseffizienz und Zelllebensfähigkeit nach Derduktion. Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine Transduktionseffizienz von bis zu 90 %, und die erzeugten Zellen können mehr als zwei Wochen in vivo überleben und den Krankheitsbeginn nach einer einzigen Infusion erheblich verzögern. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung des Zellwartungs- und Transduktionsprotokolls, so dass die kritischen Schritte leicht befolgt werden können. Die gesamte Prozedur von der primären Zellisolation bis zum CAR-Ausdruck kann innerhalb von 14 Tagen durchgeführt werden. Die allgemeine Methode kann auf jedes Mauskrankheitsmodell angewendet werden, in dem das Ziel bekannt ist. In ähnlicher Weise ist die spezifische Anwendung (die auf einen pathogenen Peptid/MHC-Klasse-II-Komplex abzielt) auf jedes andere Modell von Autoimmunerkrankungen anwendbar, für das ein Schlüsselkomplex identifiziert wurde.

Introduction

Angesichts des wahrscheinlich reduzierten Risikos unerwünschter Off-Target-Effekte sind antigenspezifische Immuntherapien (ASI) vielversprechende Behandlungen für Autoimmunerkrankungen wie T1D. Anhäufende Hinweise deuten darauf hin, dass Immunantworten auf (Prepro)Insulin bei T1D1besonders wichtig sein können. In den letzten zehn Jahren deuten Studien aus mehreren Gruppen, einschließlich unserer eigenen, stark darauf hin, dass die Darstellung eines Epitops, das Insulin-B-Kettenaminosäuren 9 bis 23 durch spezifische MHC-Klasse-II-Moleküle (B:9-23/MHCII) enthält, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von T1D bei Mäuse und Menschen2,3,4,5. Um den B:9-23/MHCII-Komplex gezielt ins Visier zu nehmen, haben wir einen monoklonalen Antikörper namens mAb287 entwickelt, der keine Kreuzreaktivität gegenüber dem Hormon Insulin oder Komplexen hat, die andere Peptide enthalten6. MAb287 blockiert die Antigen-Präsentation in vitro und die wöchentliche Verabreichung von mAb287 an prädiabetische NOD-Mäuse verzögerte die Entwicklung von T1D bei 35% der behandelten Mäuse6. Um die Antigen-Präsentation in vivo zu blockieren, sind in der Regel häufige Injektionen erforderlich, um eine hohe zirkulierende Konzentration aufrechtzuerhalten. Wir vermuteten, dass wir diese Schwierigkeit überwinden könnten, indem wir die hohe Spezifität von Ab287 nutzen, um T-Zellen neu zu programmieren, wodurch eine verbesserte antigenspezifische T-Zell-Therapie für T1D7zur Verfügung gestellt wird.

Zytotoxische T-Zellen sollen ihr Ziel töten können, wenn sogar eine einzigeKopie ihres Cognate-Ligands 8,9,10ausgedrückt wird. Daher wird erwartet, dass B:9-23/MHCII-spezifische CD8-T-Zellen eine höhere Effizienz bei der Beseitigung der unerwünschten Antigen-Präsentation aufweisen als der mutterliche Antikörper, der wahrscheinlich an mehrere Komplexe auf demselben APC binden muss, um seine Wirkung auszuüben. CAR T-Zellen wurden zur Behandlung mehrerer menschlicher Krebsarten11,12,13, und kann auch wirksam in Autoimmunität14sein. Car-T-Zellen mit Spezifität für pathogene Peptid-MHC-Komplexe wurden jedoch bisher nicht verwendet, um das Fortschreiten von T1D zu verändern. Mit der unten beschriebenen optimierten CD8 T-Zelltransduktionstechnik haben wir vor kurzem den Grundsatz beweisnachweis erbracht, dass dies tatsächlich einen praktikablen Ansatz darstellt7.

In diesem Protokoll skizzieren wir eine effiziente und schlanke Transduktions- und Expansionsmethode. Unser Protokoll gilt für andere Studien, die die Erzeugung von Maus-CD8 CAR T-Zellen mit hoher Effizienz erfordern.

Protocol

Mäuse wurden in einer Transgenen-Maus-Anlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den vom Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen durchgeführt. HINWEIS: Das Experiment erfordert die parallele Vorbereitung des Virus und der T-Zellen. Tabelle 1 fasst das Protokoll zusammen. Die wichtigsten Reagenzien und Puffer sind in der Tabelle der Materialienauf…

Representative Results

In der Regel beträgt die Transduktionseffizienz, die dieses Protokoll verwendet, 60-90 %. In dem in Abbildung 3gezeigten Experiment exprimierten vor der Sortierung etwa 70 % der CD8-T-Zellen gfP. Sie drückten auch CD28 und CD3 (Abbildung3C) aus. Wichtig ist, dass alle “Test” GFP+ Zellen auch mit IAg7-B:R3 Tetrameren ko-gefärbt werden, aber nicht mit dem Kontrolltetramer (Abbildung 4</…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Herstellung antigenspezifischer CD8 CAR-T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Die Transduktionseffizienz unseres Protokolls ist in der Regel hoch, und eine robuste Expression der CAR wird im Allgemeinen beobachtet. Die erweiterten CAR-T-Zellen behalten die wesentlichen Merkmale der elternaktivierten T-Zellen und die Antikörperspezifität bei und sind sowohl für den In-vitro- als auch für den In-vivo-Einsatz geeignet. Wir haben Ab-CAR CD8 T-Zellen bei der Neupr…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch JDRF-Stipendien 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B und SRA-2-S-2018-648-S-B, einen Diabetes Education and Action Award, und den Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine am Baylor College of Medicine. Die Zellsortierung wurde vom Cytometrie- und Zellsortierungskern am Baylor College of Medicine mit Mitteln des NIH (S10RR024574 und P30CA125123) unterstützt. Alle Peptid-MHC-Tetramere wurden aus der NIH Tetramer Core Facility gewonnen.

Materials

2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 uM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

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