배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한
Summary
ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 IslMN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.
Abstract
정확한 눈 움직임은 시력에 매우 중요하지만, 안구 모터 시스템, 특히 축사 지도를 제어하는 분자 경로의 개발은 완전히 해명되지 않았습니다. 이것은 부분적으로 전통적인 축색 지도 방법의 기술적인 한계 때문이. 오큘로모터 신경에 영향을 미치는 추가적인 축삭 유도 신호를 식별하기 위해, 눈쪽으로 성장함에 따라 실시간으로 오큘로모터 신경을 이미지화하는 생체내 슬라이스 분석법이 개발되었다. E10.5 IslMN-GFP 배아는 아가로오스에 포함시키고, 진동체에 슬라이스한 다음, 24-72시간 동안 타임랩스 광현미경으로 현미경 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시켜 생체 내 조각을 생성하는 데 사용됩니다. 핵에서 궤도에 축산의 성장의 생체 내 타이밍. 소분자 억제제 또는 재조합 단백질은 배양 배지에 첨가되어 상이한 축세포 유도 경로의 역할을 평가할 수 있다. 이 방법은 축슨이 통과하는 국소 미세 환경을 더 많이 유지하고 성장하는 축축을 축축화하지 않고 궤적을 따라 여러 지점에서 축을 평가하는 장점이 있습니다. 또한 축색의 특정 하위 집합에 미치는 영향을 식별할 수 있습니다. 예를 들면, CXCR4의 억제는 통풍구보다는 오히려 등등 성장하는 중뇌 안에 아직도 축을 일으키는 원인이 됩니다, 그러나 이미 통풍구로 종료한 축산은 영향을 받지 않습니다.
Introduction
안구 모터 시스템은 축색 가이던스 메커니즘을 조사하기 위한 우아한 시스템을 제공합니다. 그것은 눈을 움직이는 6개의 외눈 근육 (EOMs)를 심두는 3개의 두개골 신경 및 눈꺼풀을 들어 올리는 levator palpebrae 우월증 (LPS)로 이루어져 있는 상대적으로 복잡하지 않습니다. oculomotor 신경은 LPS와 4개의 EOMs를 내심합니다 – 열등한 경사및 내측, 열등한, 및 우수한 직류 근육. 다른 두 신경, trochlear 및 abducens, 각각 하나의 근육을 내면, 우수한 경사 및 측면 직사각형 근육, 각각. 눈의 움직임은 쉽게 판독할 수 있으며, 내면이 적절한지, 누락되었는지, 또는 비정상적인지를 보여 줄 수 있습니다. 추가적으로, 선천적인 두개골 배화 무질서 (CCDDs)를 집합적으로 불리는 신경 발달 또는 축세포 지도에 있는 적자에서 유래하는 인간 눈 운동 무질서가있습니다1.
이러한 장점에도 불구하고, 안구 모터 시스템은 거의 축사 유도 연구2,3,4,5,6,7,8에사용되지않습니다. 9개 , 10, 기술적 인 단점으로 인해. 시험관 내 축색안내는 많은 단점을 가지고11. 공동 배양 분석, 있는 뉴런 이식 대상 조직12 또는 형질 감염 세포13의이종과 함께 배양되는, 이식의 대칭 과 이식 과 표적 조직 사이의 정확한 위치 모두에 의존한다. 스트라이프 어세이14,15, 두 개의 큐가 교대로 줄무늬에 배치되고 축사가 하나의 스트라이프에 우선 성장을 위해 평가되는 경우, 하나의 기판이 다른 기판보다 바람직하다는 것을 나타냅니다. 또는 반발, 또는 생리학적으로 관련이 있습니다. 미세 유체 챔버는 정확한 화학 구배를 형성 할 수 있지만, 대상 성장 축은 응력16,17,18을전단, 이는 자신의 성장에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 이 접근의 각각에서, 이식 또는 해리세포를 수집하는 것은 성장하는 축삭이 축삭을 축삭화하고 따라서 이 계산이 실제로 초기 축삭 자성장 보다는 오히려 축삭 재생을 검토한다는 것을 요구합니다. 마지막으로, 이러한 시험관 내 접근법은 축축한 축세포에 영향을 미치는 미세 환경을 제거하고 코스의 다른 지점을 따라 큐에 대한 반응, 전통적으로 격리된 하나의 큐만 테스트합니다. 이러한 단점을 복합화, 안구 모터 시스템에서 각 핵의 작은 크기는 해부 기술적으로 이식 또는 해리 된 문화에 대한 도전한다. 추가적으로, 안구 운동 뉴런의 1 차적인 배양은 일반적으로 이질적이고, 중요한 세포 죽음이 있고, 다중 태아에게서 세포의 풀링을 요구하는 밀도 의존적입니다 (료스키 후지키, 개인적인 커뮤니케이션). 그러나 녹아웃 마우스 모델을 포함한 생체 내 방법은 필요한 시간과 비용을 감안할 때 스크리닝에 사용하기에 적합하지 않습니다.
배양 전체 배아19에 개발된 방법은 이동 세포20의 라벨링 또는 특정 분자21의봉쇄를 허용하지만, 전체 배아 배양은 라벨의 실시간 이미징을 배제하는 롤러 병에서 배양을 필요로 합니다. 구조. 태아의 조작을 허용하고 그 후에 추가 발달을 허용하는 외과 기술은 자궁에서 또는 어머니의 복부에 있는 (태반 연결을 유지함)22또한 가능합니다, 그러나 이들은 또한 시간 경과를 허용하지 않습니다 이미징.
시험관내 분석의 장애물을 극복하고 신호 경로의 신속한 스크리닝을 허용하기 위해, 생체내 배아 슬라이스 배양 기법은23,말초 신경 발생에 대한 이전에 발표된 프로토콜로부터 적응된24. 이 프로토콜을 사용하여, 개발 oculomotor 신경은 EOM 표적을 포함하여 그것의 궤도를 따라 그것의 궤도의 많은 의 존재에서 시간이 지남에 따라 영상화될 수 있습니다. 배양 배지에 소분자 억제제, 성장 인자 또는 안내 신호를 추가함으로써 축색 궤적을 따라 여러 지점에서 지침 교란을 평가하여 잠재적 인 성장 및 지침 요인을 보다 신속하게 평가할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 생체내 슬라이스 배양 프로토콜은 전통적인 축삭유도 분석(23)에 비해 상당한 이점을 제공한다. 각 두개골 운동 핵의 크기는 제한 요인이 아니며 어려운 해부가 필요하지 않습니다. 축사 이동을 통해 내인성 미세 환경은 다른 신호 경로를 유지하면서 하나의 신호 통로의 수정을 허용. 또한 축색 궤적을 따라 다른 지점에서 효과를 평가할 수 있습니다. 축색 안내는 경로<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
국립안과 학회 [5K08EY027850], 국립아동보건개발원 [U54HD090255], 하버드-비전 임상과학자 개발 프로그램 [5K12EY016335], 기사단 원안재단 [커리어 스타터] [교수 발견상], 어린이 병원 안과 재단 ECE는 하워드 휴즈 의학 연구소 조사관입니다.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Riferimenti
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Biologia dello sviluppo. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Biologia dello sviluppo. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
