Ein doppelt humanisiertes BLT-Mäuse-Modell mit einem stabilen humanähnlichen Gut-Mikrobiom und menschlichem Immunsystem
Summary
Wir beschreiben eine neuartige Methode zur Erzeugung doppelt humanisierter BLT-Mäuse, die über ein funktionelles menschliches Immunsystem und ein stabiles transplantiertes menschenähnliches Darmmikrobiom verfügen. Dieses Protokoll kann ohne keimfreie Mäuse oder gnotobiotische Einrichtungen befolgt werden.
Abstract
Humanisierte Mäuse (Hu-Mäuse), die über ein funktionelles menschliches Immunsystem verfügen, haben die Untersuchung menschlicher Krankheitserreger und Krankheiten grundlegend verändert. Sie können verwendet werden, um Krankheiten zu modellieren, die sonst schwierig oder unmöglich sind, bei Menschen oder anderen Tiermodellen zu studieren. Das Darmmikrobiom kann einen tiefgreifenden Einfluss auf die menschliche Gesundheit und Krankheit haben. Jedoch, das murine Darmmikrobiom ist sehr anders als das beim Menschen gefunden. Es besteht Bedarf an verbesserten präklinischen Hu-Mäuse-Modellen, die ein transplantiertes menschliches Darmmikrobiom haben. Daher haben wir Doppel-Hu-Mäuse entwickelt, die sowohl ein menschliches Immunsystem als auch ein stabiles menschenähnliches Darmmikrobiom aufweisen. nicken. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse sind aufgrund ihrer hohen Immunschwäche eines der besten Tiere für die Humanisierung. Keimfreie NSG-Mäuse und verschiedene andere wichtige keimfreie Mäusemodelle sind derzeit jedoch nicht kommerziell erhältlich. Darüber hinaus haben viele Forschungsumgebungen keinen Zugang zu gnotobiotischen Einrichtungen, und die Arbeit unter gnotobiotischen Bedingungen kann oft teuer und zeitaufwändig sein. Wichtig ist, dass keimfreie Mäuse mehrere Immunschwächen haben, die auch nach der Transplantation von Mikroben bestehen. Deshalb haben wir ein Protokoll entwickelt, das keine keimfreien Tiere oder gnotobiotischen Einrichtungen erfordert. Um Doppel-Hu-Mäuse zu erzeugen, wurden NSG-Mäuse vor der Operation mit Strahlung behandelt, um Knochenmark-, Leber-, Thymus-humanisierte (hu-BLT) Mäuse zu erzeugen. Die Mäuse wurden dann mit Breitspektrum-Antibiotika behandelt, um das bereits vorhandene murine Darmmikrobiom zu erschöpfen. Nach einer Antibiotika-Behandlung erhielten die Mäuse Fäkaltransplantationen mit gesunden menschlichen Spenderproben per oraler Gavage. Doppel-Hu-BLT-Mäuse hatten einzigartige 16S rRNA-Genprofile, die auf der einzelnen menschlichen Spenderprobe basierten, die transplantiert wurde. Wichtig ist, dass das transplantierte menschenähnliche Mikrobiom in den doppelhu-BLT-Mäusen für die Dauer der Studie bis zu 14,5 Wochen nach der Transplantation stabil war.
Introduction
Humanisierte Mäuse (Hu-Mäuse) haben die Untersuchung vieler Aspekte der menschlichen Gesundheit und Krankheit verändert, einschließlich Hämatopoese, Immunität, Krebs, Autoimmunerkrankung und Infektionskrankheit1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Diese Hu-Mäuse haben den deutlichen Vorteil gegenüber anderen Mausmodellen, da sie ein funktionelles menschliches Immunsystem haben und mit humanspezifischen Krankheitserregern infiziert werden können. Dennoch hat sich die Bedeutung des Darmmikrobioms durch seine Rolle bei vielen menschlichen Krankheiten wie Fettleibigkeit, metabolischem Syndrom, entzündlichen Erkrankungen und Krebs10,11,12, 13. Das Schleimhaut-Immunsystem und Das Darmmikrobiom sind wechselseitig reguliert, um Darm und systemische Homöostase aufrechtzuerhalten. Das Immunsystem wird durch Antigene des Darmmikrobioms geformt und umgekehrt spielt das Immunsystem eine wichtige regulatorische Rolle bei der Förderung von darmen Darmbakterien und der Eliminierung von Krankheitserregern14,15, 16. Allerdings ist das Darmmikrobiom von Hu-Mäusen nicht gut charakterisiert und das murine Darmmikrobiom unterscheidet sich in Zusammensetzung und Funktion wesentlich von Menschen17. Dies ist auf evolutionäre, physiologische und anatomische Unterschiede zwischen dem murinen und menschlichen Darm sowie andere wichtige Faktoren wie Ernährung zurückzuführen, die die experimentellen Ergebnisse der Hu-Mäuse-Krankheitsmodelle beeinflussen können18. Daher wird über die Klassifizierung des murinen Darmmikrobioms von Hu-Mäusen hinaus ein Tiermodell benötigt, das sowohl ein menschliches Immunsystem als auch ein menschliches Darmmikrobiom zeigt, um die komplexen Wechselwirkungen menschlicher Krankheiten in vivo zu untersuchen.
Das Studium menschlicher Krankheiten direkt beim Menschen ist oft unpraktisch oder unethisch. Viele Tiermodelle können nicht zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger wie dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) verwendet werden. Nichtmenschliche Primatenmodelle sind genetisch ausgezüchtet, sehr teuer und nicht anfällig für viele menschliche Krankheitserreger. Mäuse, die als keimfrei (GF) abgeleitet und mit menschenähnlichen Darmmikrobiomen rekonstituiert wurden, wurden weit verbreitet verwendet, um die menschliche Gesundheit und Krankheit zu studieren19,20. Diese Tiere haben jedoch kein menschliches Immunsystem und die Arbeit mit GF-Tieren erfordert spezielle Einrichtungen, Verfahren und Fachwissen. Daher ist es notwendig, verbesserte präklinische Modelle zu studieren, um die komplexe Beziehung des Darmmikrobioms und des menschlichen Immunsystems zu untersuchen. Viele Stämme von Mäusen, wie NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sind nicht als GF erhältlich. GF-Tiere können auch an langanhaltenden Immunschwächen leiden, die durch die Transplantation von Mikroben nicht vollständig umgekehrt werden21. Daher haben wir eine doppelhu-Mäuse mit einem funktionellen menschlichen Immunsystem und stabilem menschenähnlichen Darmmikrobiom unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen entwickelt. Um Doppel-Hu-Mäuse zu erzeugen, wurde an NSG-Mäusen operiert, um Knochenmark, Leber, Thymus humanisierte Mäuse (hu-BLT) zu erzeugen. Die hu-BLT-Mäuse wurden dann mit Breitspektrum-Antibiotika behandelt und dann mit einer gesunden menschlichen Spenderprobe fäkal transplantiert. Wir charakterisierten das bakterielle Darmmikrobiom von 173 Fäkalienproben von 45 doppelhu-BLT-Mäusen und 4 menschlichen Fäkalien-Spenderproben. Doppel-Hu-BLT-Mäuse haben einzigartige 16S rRNA-Genprofile, die auf der einzelnen menschlichen Spenderprobe basieren, die transplantiert wird. Wichtig ist, dass das transplantierte menschenähnliche Mikrobiom bei den Mäusen für die Dauer der Studie bis zu 14,5 Wochen nach der Transplantation stabil war. Darüber hinaus zeigten die vorhergesagten Metagenome, dass Doppel-Hu-BLT-Mäuse eine andere vorhergesagte funktionelle Kapazität haben als Hu-Mäuse, die den menschlichen Spenderproben ähnlicher sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ist für die Schaffung von doppelhu-BLT-Mäusen, die sowohl ein funktionelles menschliches Immunsystem als auch ein stabiles menschenähnliches Darmmikrobiom aufweisen. Dieses Protokoll kann an andere humanisierte oder nicht-humanisierte Mäusemodelle angepasst werden, ohne dass GF-Tiere und gnotobiotische Einrichtungen benötigt werden. Während die hier beschriebenen Methoden relativ einfach sind, gibt es einige kritische Details, die für die erfolgreiche Erstellung von Doppelhu-BLT-Mä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Yanmin Wan, Guobin Kang und Pallabi Kundu für ihre Unterstützung bei der Erzeugung von BLT-humanisierten Mäusen. Wir möchten die UNMC Genomics Core Facility würdigen, die teilweise Unterstützung vom Nebraska Research Network In Functional Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology of Neurosensory Systems CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela erhält. Buffett Cancer Center – P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, und die Nebraska Research Initiative. Wir danken der University of Nebraska – Lincoln Life Sciences Annex und ihren Mitarbeitern für ihre Unterstützung. Diese Studie wird teilweise von den National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Erstellung des Manuskripts oder der Entscheidung für die Veröffentlichung.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
Riferimenti
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