이 연구는 1) 인간 에서독점적으로 인간 신경 유기 체 내 인간 교모세포종 개발 및 2) 뉴런 도파민성 연구를 위한 관련 및 정확한 모델로 두 개의 특정 인간 신경 오르가노이드를 도출하는 프로토콜을 소개하고 기술합니다. 3차원 오르가노이드를 생성하는 분화.
관련 생체 외 신경 모델의 부족은 신경 병 증에 대 한 의료 진행에 중요 한 장애물. 관련 세포 모형의 설치는 이 질병의 병리학 적인 기계장치를 더 잘 이해하고 새로운 치료 표적 및 전략을 확인하기 위하여 둘 다 중요합니다. 관련이 있기 위해서는 시험관 내 모델이 인간 질병의 병리학 적 특징을 재현해야합니다. 그러나, 신경 퇴행성 질환의 맥락에서, 관련 시험관 내 모델은 귀중한 치료 기회로 신경 세포 교체를 제공해야합니다.
이러한 모델은 치료 분자의 스크리닝을 허용할 뿐만 아니라 신경 프로토콜 분화를 최적화하는 데에도 사용될 수 있다[예를 들어, 파킨슨병(PD)]에서 이식의 맥락에서]. 본 연구는 1) 인간 신경 오르가노이드 내 인간 교모세포종 발달(NO) 및 2) 3차원(3D) 오르가노이드를 생성하는 신경 도파민성(DA) 분화의 2개의 시험관내 프로토콜을 기술한다. 이를 위해, 인간 배아 줄기 세포(hESC) 분화로부터 유래된 크기 보정된 신경구의 생산을 허용하는 잘 표준화된 프로토콜이 확립되었다. 첫 번째 모델은 신경 오르가노이드 내의 교모세포종 발달 중에 발생하는 분자 및 세포 이벤트를 밝히는 데 사용될 수 있으며, DA 오르가노이드는 파킨슨 병의 세포 치료를위한 DA 뉴런의 적절한 공급원을 나타낼뿐만 아니라 약물 검사에 사용할 수 있습니다.
세계 보건 기구 (WHO)는 낮은 학년 (II 등급) 또는 높은 등급 (학년 III 및 IV)로 성상 세포종을 분류합니다. 교모세포종 다형성 (GBM)은 성상 세포종 등급 IV, 1 차적인 뇌종양의 가장 치명적인,즉 치료의 모든 현재 형태에 저항1. 신경 외과, 화학 요법 및 방사선 요법을 포함한 표준 치료 치료에도 불구하고 GBM은 여전히 치명적이며 15 개월 전체생존율은 지난 15 년 동안 극적으로 변하지 않았습니다 2. GBM 병인을 이해하는 데 상당한 진전을 이루기 위해 관련 모델의 사용이 중요합니다. 지금까지 GBM의 연구는 자발적종양을 개발하는 쥐 또는 형질전환 마우스로 세포주, 설치류 organotypic 슬라이스, 및 환자 유래세포의 이종이식에 의존해 왔다 3,4. 이 모형은 두뇌 전이 및 종양 공격성을 공부하는 것이 유용했더라도, 그(것)들은 종 사이 다름에 의해 제한되고, 그 결과로 결론은 인간 조직으로 잘못 번역될 수 있습니다. 더욱이, 인간 세포를 가진 기존 모형은 또한 호스트조직/종양 상호 작용의 부재에 의해 제한됩니다 3,4. 실험 모델은 기초 과학에서 치료 대상으로의 번역에 매우 중요합니다. 따라서 GBM-발병 세포(GIC)와 함께 배양된 시험관 내 인간 신경 오르가노이드를 생산하는 프로토콜을 기술하는 것은 GBM 개발의 형태학적 및 기능적 특징을 모방하는 관련 시스템을 제공할 수 있다. 이 시스템은 침입 세포 및 괴사 영역의 확산 이동과 같은 GBM 발달의 생체 내 기능을 재현하고 종양 생물학과 관련된 유전자 발현을 강조합니다. 이전에 밝혀진 바와 같이, 몇몇 중요한 microRNAs는 3D신경 조직 내의 GIC 발달 도중 유도됩니다 5,6.
PD는 주요 신경 퇴행성 질환이며 다중 신경 아류형의 변성과 관련된7. 증상의 점진적 발병 (예를 들어, 운동 상실, 비대칭 휴식 떨림, 강성 및 자세 불안정성)이 질병을 특징짓는 경우에도 정확한 병인은 명확하게 확립되지 않습니다. 실제로, 많은 연구 결과는 중요한 위험 요소가 유전과 환경 요인의 조합에서 유래할 수 있다는 증거를 강조했습니다. 파킨슨병 증상은 서브스타민니아니그라(SN)에서 도파민성 뉴런의 양측 변성과 연관되며, 줄무늬8,9에돌출되는 도파민성(DA) 축종의 실종으로 이어진다. 따라서, striatal 도파민 수준의 감소는 PD 환자에서 모터 기능 장애의 진행과 상관 관계가 있다. 도파민성 뉴런은 아미노산 L-티로신을 L-3,4-디하이드록시페닐라닌(L-DOPA, 도파민 전구체)으로 변환하는 카테콜라미네르성 신경전달물질의 합성에 핵심적인 효소인 티로신 하이드록실라제(TH)를 함유하고 있다. TH 단백질 발현의 감소에 이어 TH 활성의 조기 손실은 PD의 특징이다.
이 연구는 TH 양성 세포로 농축 된 중뇌 와 같은 표현형을 지향한 인간 신경 오르가노이드를 사용하는 두 가지 프로토콜을 설명합니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 측면 중 하나는 세포 배양 및 구체 및 신경 조직 형태학의 면밀한 모니터링 동안 hESC 다능성의 유지를 포함한다. hESCs는 매우 민감하며 모든 조작은 세포 사멸뿐만 아니라 조기 통제되지 않은 분화로 이어질 수 있습니다. 실험 적 재현성을 높이고 비정상적인 karyotype 이벤트의 발생을 피하기 위해 염색체 안정성의 검증 후 가장 낮은 통로에서 여러 배치의 hESCs를 냉동 보존하는 것이 좋습니다. 또한, 각 실험에 대한 새로운 바이알을 해동하고 매일 세포의 행동을 확인하는 것이 좋습니다. 구체가 비정상적으로 높은 크기로 굴절이 적으면 집계되어 죽기 시작할 수 있습니다.
이 시스템에 대한 하나의 개선은 관류 또는 혈관화 시스템(내피 세포를 추가하거나 3D 유체 마이크로칩내)을 구현하는 것이다 12,13. 그러나 신경 오르가노이드(≤300 μm)의 두께를 제어하면 산소와 영양의 효율적인 수동 관류가 가능하고 괴사를 방지할 수 있습니다. 또 다른 개선은 면역 세포 (microglia)의 도입이다. 마음에 이러한 제한, 신경 오르가노이드 플러스 GIC 시스템은 여러 가지 이유로 관련 도구가 될 수 있습니다. 첫째, 이 시스템은 약물 스크리닝을 통해 치료 화합물이 오르가노이드 또는 종양 세포에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 모니터링할 수 있습니다. 둘째, 세포 간 상호 작용을 연구할 수 있으며, 개인 및 집단 침략의 근간이 되는 미세 환경 결정요인을 5,6,13을시각화하고 탐구할 수 있다.
파킨슨 병의 맥락에서, DA 뉴런이 풍부한 신경 오르가노이드는 질병 발달을 연구하기 위해 관련성 있고 정확한 3D 모델을 나타낼 수 있습니다. 이전 연구에서, DA 뉴런으로 분화 된 파킨슨 병 환자 유래 유도 만능 줄기 세포는 영향을받는 신경 아류형을 연구하는 데 사용되었습니다. 참고로, α-synuclein의 축적과 같은 일부 질병 관련 표현형및 산화 스트레스에 대한 민감성은14,15로관찰되었다. 더욱이, 신경 오르가노이드는 치료 분자를 스크리미는 도구로 사용될 수 있다. 그러나, 특정 하 고 관련 된 판독 DA 신경 생존 및 기능을 평가 하도록 설정 해야 합니다., 도파민 생산 및 전기 생리 활성 등. 전부, 이 프로토콜은 신경 오르가노이드를 생성하는 2개의 표준화되고 정확한 줄기 세포 기지를 둔 접근을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 라 리그 제네보이스 콘트레 르 암 (제네바, 스위스), ISREC 재단 (로잔, 스위스), 그리고 연구를위한 클레이튼 재단 (휴스턴, 텍사스, 미국) 재정 지원을 감사드립니다. 또한, 저자는 HES-HO와 와이스 센터에 재정 지원을 감사드립니다. 우리는 도움이 토론과 지원에 대한 크라우스의 실험실과 교정에 대한 박사 할라 쿠태쉬에 감사드립니다.
6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |