Formação de carbonato de cálcio na presença de aditivos Biopoliméricos

A biomineralização é a formação de minerais na presença de moléculas orgânicas, muitas vezes relacionadas com papéis funcionais e/ou estruturais em organismos vivos. A biomineralização pode ser intracelular, como na formação de magnetita dentro de bactérias magnetotáticas¹, ou extracelular, como na formação de carbonato de cálcio em picos de ouriço-do-mar², de hidroxiapatita que está relacionada com colágeno em ossos³ e do esmalte que está associado com amelogenina nos dentes⁴. A biomineralização é um processo complexo que depende de muitos parâmetros no organismo vivo. Portanto, a fim de simplificar o sistema em estudo, é necessário avaliar o efeito de componentes separados no processo. Em muitos casos, a biomineralização é induzida pela presença de biopolímeros extracelulares. O objetivo do método aqui apresentado é o seguinte: (1) formar cristais de carbonato de cálcio na presença de biopolímeros isolados in vitro, utilizando um método de difusão de vapor. (2) estudar o efeito dos biopolímeros na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio.

São utilizados três métodos principais para precipitar o carbonato de cálcio in vitro na presença de aditivos orgânicos^5,6. O primeiro método, que vamos referir como o método de solução, é baseado na mistura de um sal solúvel de cálcio (por exemplo, CaCl₂) com um sal solúvel de carbonato (por exemplo, carbonato de sódio). O processo de mistura pode ser realizado de várias maneiras: dentro de um reator com três células separadas por membranas porosas⁷. Aqui, cada uma das células exteriores contém um sal solúvel e a célula central contém uma solução com o aditivo a ser testado. O cálcio e o carbonato difuso do exterior à pilha média, tendo por resultado a precipitação do carbonato de cálcio menos solúvel quando as concentrações de cálcio e de carbonato excedem seu produto da solubilidade, K_SP = [Ca^{2 +}] [co₃ ^2-]. Um método de mistura adicional é o procedimento de jato duplo⁸. Neste método, cada sal solúvel é injetado a partir de uma seringa separada para uma solução agitada contendo o aditivo, onde o carbonato de cálcio precipita. Aqui, a injeção e, portanto, a taxa de mistura é bem controlada, em contraste com o método anterior, onde a mistura é controlada pela difusão.

O segundo método usado para cristalizar CaCO₃ é o método Kitano⁹. Este método baseia-se no equilíbrio carbonato/carbonato de hidrogênio (2HCO₃^– _(AQ) + CA^{2 +}_(AQ) caco_{3 (s)} + co_{2 (g)} + H₂O _(l)). Aqui, o CO₂ é borbulhado em uma solução contendo caco₃ em uma forma sólida, deslocando o equilíbrio para a esquerda e, portanto, dissolvendo o carbonato de cálcio. O carbonato de cálcio não dissolvido é filtrado e os aditivos desejados são adicionados à solução rica em bicarbonato. O CO₂ é então autorizado a evacir, deslocando assim a reacção à direita, formando carbonato de cálcio na presença dos aditivos.

O terceiro método de cristalização do carbonato de cálcio, que descreveremos aqui, é o método de difusão de vapor¹⁰. Nesta set-up, o aditivo orgânico, dissolvido em uma solução de cloreto de cálcio, é colocado em uma câmara fechada perto de carbonato de amônio em forma de pó. Quando o pó de carbonato de amônio se decompõe em dióxido de carbono e amônia, eles se difusas na solução contendo íons de cálcio (por exemplo, CaCl₂), e o carbonato de cálcio é precipitado (ver Figura 1 para ilustração). Os cristais do carbonato de cálcio podem crescer pela precipitação lenta ou pela precipitação rápida. Para a precipitação lenta, uma solução que contenha o aditivo na solução de CAcl₂ é coloc em um exsicador ao lado do pó do carbonato de amónio. Na precipitação rápida, descrita de comprimento no protocolo, tanto a solução aditiva quanto o carbonato de amônio são colocados mais próximos em uma placa de múltiplos poços. O método de precipitação lenta produzirá menos centros de nucleação e cristais maiores, e a precipitação rápida resultará em mais centros de nucleação e cristais menores.

Os métodos descritos acima diferem em sua complexidade técnica, no nível de controle e na taxa do processo de precipitação. O método de mistura requer uma set-up especial⁶ para o jato duplo e o sistema de três células. No método de mistura, a presença de outros íons contrários solúveis (por exemplo, na⁺, CL^–)⁶ é inevitável, enquanto que no método Kitano, o cálcio e (BI) carbonato são os únicos íons em solução e não envolve a presença de adicionais contra íons (por exemplo, na⁺, CL^–). Além disso, o método de mistura requer volumes relativamente grandes e, portanto, não é adequado para trabalhar com biopolímeros caros. A vantagem do jato dobro é que é possível controlar a taxa de injeção da solução e que é um processo rápido em comparação com outros métodos.

A vantagem do método de Kitano e o método de difusão de vapor é que a formação de carbonato de cálcio é controlada pela difusão de CO₂ em/fora de uma solução CAcl₂ , permitindo assim a sonda de nucleação mais lenta e processos de precipitação ¹¹ anos de ^{, 12}. Além disso, a formação de carbonato de cálcio por difusão de co₂ pode assemelhar-se a processosde calcificação in vivo^13,14,15. Neste método, os cristais bem definidos e separados são formados¹⁶. Por último, o efeito de biopolímeros únicos ou múltiplos na formação de carbonato de cálcio pode ser testado. Isto permite um estudo sistemático do efeito de uma série de concentrações aditivas na formação de carbonato de cálcio, bem como um estudo de misturas de biopolímeros-todos realizados de forma controlada. Este método é adequado para uso com uma grande variedade de concentrações e volumes de aditivos. O volume mínimo utilizado é de aproximadamente 50 μL e, portanto, este método é vantajoso quando há uma quantidade limitada de biopolímeros disponíveis. O volume máximo depende da acessibilidade de uma placa de poço maior, ou do dessecador em que a placa ou taça contendo CaCl₂ devem ser inseridos. O método descrito abaixo foi otimizado para trabalhar em uma placa 96-well com um biopolímero escolhido para ser a proteína TapA¹⁷.