Automatisierte Messungen des Schlafes und Bewegungsorgane Aktivität im mexikanischen Cavefish
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Quantifizierung der Bewegungsorgane Verhalten und Schlaf in der mexikanischen Cavefish. Frühere Analysen werden erweitert, um diese Verhaltensweisen in sozial untergebracht Fisch zu messen. Dieses System kann weit angewendet werden, um Schlaf und Aktivität in anderen Fischarten zu studieren.
Abstract
Über Stämme zeichnet sich Schlaf durch hoch konservierte Verhaltensmerkmale, die gehören erhöhte Erregung Schwelle, rebound nach Schlafentzug und Perioden des Verhaltens Unbeweglichkeit konsolidiert. Die mexikanische Cavefish Astyanax Mexicanus (A. Mexicanus),, ist ein Modell für Studium Merkmal Evolution als Reaktion auf ökologische Störung. A. Mexicanus vorhanden wie Augen Oberfläche Wohnformen und mehrere blinde höhlenbewohnenden Bevölkerungen, die robuste morphologischen und verhaltensbezogene Unterschiede aufweisen. Schlafmangel ist in mehrere, unabhängig voneinander entwickelt Cavefish Bevölkerungen aufgetreten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Quantifizierung der Schlaf und Bewegungsorgane Aktivität in A. Mexicanus Höhle und Oberfläche Fisch. Eine kostengünstige Videoüberwachungssystem ermöglicht Verhaltens Bildgebung einzeln untergebracht Larven oder Erwachsene Fische über einen Zeitraum von einer Woche oder länger. Das System kann angewendet werden, um im Alter von 4 Tagen Post Befruchtung bis ins Erwachsenenalter zu fischen. Der Ansatz kann auch zur Messung der Auswirkungen sozialer Interaktionen auf den Schlaf durch Aufnahme mehrere Fische in einer einzigen Arena angepasst werden. Nach behavioral Aufnahmen Daten werden analysiert, mit tracking-Software automatisiert und Schlafanalyse ist mit benutzerdefinierte Skripts, die mehrere Schlaf Variablen einschließlich Dauer, Kampf und Kampf Anzahl quantifizieren verarbeitet. Dieses System kann auf Maß Schlaf, circadiane Verhalten und Bewegungsorgane Tätigkeit in fast alle Fischarten, darunter Zebrafisch und Stichlinge angewendet werden.
Introduction
Schlaf ist im gesamten Tierreich auf der physiologischen, funktionellen und verhaltensbezogenen Ebene1,2,3hoch konserviert. Während Schlaf bei Säugetieren Versuchstieren in der Regel Elektroenzephalogramme anhand ist, elektrophysiologische Aufnahmen sind weniger praktisch in kleinen genetisch zugänglich Modellsystemen und somit Schlaf ist in der Regel gemessen basierend auf Verhalten3 , 4. Verhaltensmerkmale Schlaf zugeordnet sind hoch konserviert im gesamten Tierreich und erhöhte Erregung Schwelle, Reversibilität mit Stimulation und anhaltenden Verhaltensstörungen Ruhe5enthalten. Diese Maßnahmen können verwendet werden, um Schlaf bei Tieren von der Nematoden Wurm, C. Elegans, durch Menschen6bis hin zu charakterisieren.
Die Verwendung von Verhaltensstörungen Ruhe, Schlaf zu charakterisieren erfordert automatisierte Tracking-Software. Mit tracking-Software, Perioden von Aktivität und Unbeweglichkeit sind bestimmt über mehrere Tage und lange Perioden der Inaktivität werden eingestuft, wie schlafen7,8. In den letzten Jahren wurden mehrere Tracking-Systeme für den Erwerb von Aktivitätsdaten unter eine Vielfalt an kleinen genetisch zugänglich Modellsysteme entwickelt; auch Würmer, Fruchtfliegen und Fisch9,10,11. Diese Programme werden durch die Software begleitet, die ermöglicht die automatische Verfolgung des tierischen Verhaltens, einschließlich der open-Source-Freeware und kommerziell verfügbare Software7,12,13,14 . Diese Systeme unterscheiden sich in ihrer Flexibilität und ermöglichen eine effiziente Sortierung und Charakterisierung von Schlaf Phänotypen in zahlreichen genetisch amendable Modelle.
Genetische Untersuchung des Schlafes in den Zebrafish Danio Rerio, führte zur Identifizierung von zahlreichen Genen und neuronale Schaltkreise, die Schlaf15,16Regeln. Dies hat ein leistungsfähiges System zur Erforschung der neuronalen Grundlagen des Schlafes in einem Wirbeltier Labortier, viel weniger ist bekannt über wie Schlaf entwickelt und wie natürliche trägt Variation Verordnung schlafen. Die mexikanische Cavefish, Astyanax Mexicanus (A.) Mexicanus), dramatische Unterschiede in den Schlaf, lokomotorischen Tätigkeit und Tagesrhythmus17,18entwickelt haben. Diese Fische gibt es Augen Oberfläche Fische, die die Flüsse von Mexiko und Süd-Texas und mindestens 29 bewohnen Populationen in der Sierra Del Abra-Region des nordöstlichen Mexiko19,20,21Höhle. Bemerkenswert ist, scheinen viele Verhaltensunterschiede, einschließlich Schlafverlust, unabhängig voneinander in mehreren Cavefish Populationen14,22entstanden sind. Cavefish bieten daher ein Modell für die Untersuchung die konvergente Entwicklung des Schlafes, circadiane, und Sozialverhalten.
Dieses Protokoll beschreibt ein System zur Messung von Schlaf und Bewegungsorgane Verhalten in A. Mexicanus Larven und Erwachsene. Eine maßgeschneiderte Infrarot-basierte Aufnahme-System ermöglicht video-Aufzeichnung von Tieren unter hellen und dunklen Bedingungen. Kommerziell verfügbare Software kann verwendet werden, um die Aktivität zu messen und benutzerdefinierte Makros werden verwendet, um verschiedene Aspekte der Inaktivität zu quantifizieren und Perioden des Schlafes zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt auch experimentelle Änderungen für die Verfolgung der Aktivitäten von mehreren Tieren in einem Tank, die Möglichkeit bietet, die Wechselwirkungen zwischen Schlaf und Sozialverhalten zu untersuchen. Diese Systeme können auf Maß Schlaf, circadiane Verhalten und Bewegungsorgane Aktivität in zusätzliche Fischarten, darunter Zebrafisch und Stichlinge angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein maßgeschneidertes System zur Quantifizierung der Schlaf und Bewegungsorgane Aktivität bei Larven und adulten Cavefish. Cavefish entstanden als führende Modell für das Studium der Evolution des Schlafes, die verwendet werden kann, um die genetischen und neuronalen Grundlagen der Schlaf Verordnung1zu untersuchen. Die entscheidenden Schritte in dieses Protokoll gehören Optimierung der Beleuchtung und Videoqualität um genaues tracking zu gewährleisten ist notwend…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIGMS GM127872 ACK, NINDS Award 105072 ERD und ACK, und NSF Award 1656574, ACK unterstützt.
Materials
| 12V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25pcs 1W 3W 5W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90 degree pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
Riferimenti
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J. Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep. Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).
- Allada, R., Siegel, J. M. Unearthing the phylogenetic roots of sleep. Current biology. 18, R670-R679 (2008).
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti, ., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
