Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Un problema centrale in campo biomedico consiste nel determinare i meccanismi con cui viene regolato ogni gene umano. Trascrizione è il primo passo nel controllo dei livelli di espressione genica, ed è regolato da un insieme di fattori di trascrizione (TFs) che sono unici per ogni gene. Dato che gli esseri umani codificano per > 1.500 TFs^1,2, identificando il set completo di TFs che controllano l’espressione di ogni gene rimane una sfida aperta.

Due tipi di metodi possono essere utilizzati per mappare le interazioni TF-DNA: Metodi TF-centrato e DNA-centrato³ (Figura 1A). Nei metodi TF-centrato, è sondato un TF di interesse per l’associazione a regioni del DNA genomiche o per determinare la specificità di legame del DNA. Questi metodi includono l’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da sequenziamento ad alta produttività, microarrays della proteina vincolante e SELEX^4,5,6. Nei metodi del DNA-centrato, una sequenza di DNA di interesse è sondata per determinare l’insieme di TFs che si legano alla sequenza di DNA. Il più ampiamente applicata di tali metodi è saggi di lievito monoibrido (Y1H), nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell’ambito del nucleo di lievito utilizzando reporter geni^7,8,9.

Y1H saggi riguardano due componenti: una ‘DNA-bait’ (ad es., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una ‘TF-preda,’ che possa essere sottoposti a screening per reporter gene attivazione^9,10 (Figura 1B). Il DNA-esca è clonato a Monte di due reporter geni (LacZ e HIS3) e due costrutti di DNA-bait::reporter sono integrati nel genoma del lievito per generare cromatinici ‘DNA-esca ceppi.’ La TF-preda, codificata in un plasmide che esprime un TF fuso per il dominio di attivazione (AD) del lievito Gal4 TF, è stato introdotto nel ceppo di DNA-esca per i pesci per le interazioni di TF-DNA. Se la TF-preda si lega alla sequenza di DNA-esca, quindi l’annuncio presente nella TF-preda porterà all’attivazione di entrambi i geni reporter. Di conseguenza, cellule con un’interazione positiva possono essere selezionate per la crescita sulle piastre carente istidina, come pure di superare un inibitore competitivo, 3-ammino-1,2,4-triazolo (3-AT) e visualizzate come colonie blu in presenza di X-gal. Perché il potente lievito Gal4 è utilizzato AD, saggi di Y1H in grado di rilevare le interazioni che coinvolgono attivatori trascrizionali come repressori. Inoltre, dato che TF-prede sono espressi da un promotore forte lievito (ADH1), interazioni possono essere rilevati anche per TFs che hanno livelli di bassa espressione endogena, che sono difficili da rilevare da ChIP^11,12.

Più i protocolli pubblicati per eseguire dosaggi Y1H si basano sull’introduzione di TF-prede nei ceppi di lievito DNA-esca trasformando in pool librerie di TF-preda seguite da selezione, Colonia raccogliendo e sequenziamento per identificare il TF interagenti, o da trasformazione di singoli cloni^8,9. Si tratta di protocolli che richiede tempo, limitando il numero di sequenze di DNA che può essere testato per ricercatore. Un recente miglioramento delle analisi Y1H, chiamato enhanced Y1H (eY1H), ha aumentato drammaticamente il throughput screening utilizzando una piattaforma robotica di matrice (HDA) ad alta densità di accoppiarsi ceppi di lievito DNA-esca con una collezione di ceppi di lievito ognuno esprimendo un diverso TF-preda^10,13 (Figura 1). Questi schermi utilizzano un formato di 1.536 Colonia che permette di testare più umano TFs in quadruplice copia utilizzando solo tre piastre. Inoltre, dato che interazioni TF-DNA sono testati in maniera pairwise, questo approccio consente per confrontare le interazioni tra DNA-esche (ad esempio, due varianti non codificanti singolo nucleotide) e tra diversi TFs o TF varianti^{11,12 ,14}.

Facendo uso delle analisi di eY1H, abbiamo delineato l’umano più grande e Caenorhabditis elegans TF-DNA DNA-centrato interazioni reti a-data. In particolare, abbiamo identificato 2.230 interazioni tra 246 rinforzatori inerente allo sviluppo umani e 283 TFs¹². Ulteriormente, abbiamo impiegato le analisi eY1H per scoprire associazione TF alterata a 109 varianti non codificante di singolo nucleotide associate a malattie genetiche come la malformazione inerente allo sviluppo, il cancro e disturbi neurologici. Più recentemente, abbiamo usato eY1H per delineare una rete formata da 21.714 interazioni tra 2.576 promotori di geni di c. elegans e 366 TFs¹¹. Questa rete è stato determinante per scoprire il ruolo funzionale di decine di c. elegans TFs.

I protocolli per generare macchie di DNA-esca e valutare i livelli di attività del reporter di sfondo sono state segnalate altrove^15,16,17. Qui, descriviamo una pipeline di eY1H che può essere utilizzata per qualsiasi regione di DNA genomico umano contro una matrice di 1.086 TFs umano a schermo. Una volta che viene generato un DNA-esca ceppo di lievito e una matrice di TF-preda è macchiata sulle piastre corrispondente, l’intero protocollo può essere eseguita in due settimane (tabella 1). Ancora più importante, il protocollo può essere parallelizzato in modo che un singolo ricercatore può schermo 60 sequenze di DNA-esca simultaneamente. Per illustrare il protocollo, abbiamo proiettato i promotori di due geni di citochine CCL15 e IL17F. Inoltre, mostreremo risultati dalla fallita schermate per illustrare i tipi di problemi che possono sorgere durante l’esecuzione di analisi di eY1H e come risolverli.