Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano
Summary
Aquí, presentamos una levadura mejorada Detección protocolo para identificar los factores de transcripción (TFs) que se pueden unir a una región de ADN humana de interés de uno híbrido. Este método utiliza una tubería de proyección de alto rendimiento que puede interrogar el atascamiento de > 1.000 TFs en un solo experimento.
Abstract
Identificar los conjuntos de factores de transcripción (TFs) que regulan cada gen humano es una tarea de enormes proporciones que requiere la integración de numerosos enfoques experimentales y computacionales. Un tal método es el ensayo levadura uno híbrido (Y1H), en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de levadura usando genes del reportero. Y1H ensayos implican dos componentes: un ‘ADN-bait’ (por ejemplo., promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un ‘TF-presa,’ que puede ser examinado para la activación del gen reportero. Más publicados protocolos para realizar Y1H pantallas se basan en transformar cepas de levadura DNA-cebo TF-presa bibliotecas o arreglos de discos. Aquí, describimos un gasoducto, llamado Y1H mejorada (eY1H) de ensayos, donde las interacciones TF-DNA son interrogadas por el apareamiento de las cepas de ADN-cebo con una colección vestida de TF-presa cepas utilizando una matriz de alta densidad plataforma robótica (HDA) que permite la proyección en un 1.536 formato de la Colonia. Esto permite un aumento dramático en el rendimiento (60 secuencias de ADN-cebo contra > 1.000 TFs tarda dos semanas por el investigador) y reproducibilidad. Ilustran los diferentes tipos de resultados esperados analizando secuencias del promotor humano contra una gran variedad de 1.086 TFs humanas, así como ejemplos de problemas que pueden surgir durante la pantallas y cómo solucionarlos problemas.
Introduction
Un problema central en el campo biomédico es determinar los mecanismos por el que se regula cada gene humano. La transcripción es el primer paso en el control de los niveles de expresión de genes, y es regulado por sistemas de factores de transcripción (TFs) que son únicos a cada gen. Dado que los seres humanos codifican para > 1.500 TFs1,2, identificar el conjunto completo de TFs que controlan la expresión de cada gen sigue siendo un desafío abierto.
Dos tipos de métodos se pueden utilizar para mapear las interacciones TF-DNA: métodos TF-centrado y centrado en la DNA3 (figura 1A). En métodos centrados en el TF, TF de interés es sondeado para atar regiones genómicas de ADN y determinar su especificidad de unión del ADN. Estos métodos incluyen la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguida por secuenciación de alto rendimiento, microarrays de la proteína vinculante y SELEX4,5,6. En los métodos centrados en el ADN, una secuencia de ADN de interés es sondada para determinar el conjunto de TFs que se unen a la secuencia de ADN. El más ampliamente aplicado de tales métodos es los ensayos (Y1H) levadura uno híbrido, en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de la levadura utilizando reporter genes7,8,9.
Y1H ensayos implican dos componentes: un ‘ADN-bait’ (por ejemplo, promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un ‘TF-presa,’ que puede ser evaluado para reportero gene activación9,10 (figura 1B). El cebo de ADN se clona río arriba del reportero dos genes (LacZ y HIS3) y ambos constructos de ADN-bait::reporter se integración en el genoma de la levadura para generar chromatinized ‘cepas de ADN-bait’. TF-presa, codificada en un plásmido que expresa un TF fusionados con el dominio de activación (AD) de la levadura Gal4 TF, se introduce en la cepa de ADN-cebo para pescar las interacciones TF-DNA. Si la TF-presa se une a la secuencia de ADN-bait, el anuncio en la TF-presa dará lugar a la activación de ambos genes del reportero. Como resultado, las células con una interacción positiva pueden seleccionadas para el crecimiento en las placas que carecen de histidina, así como la superación de un inhibidor competitivo, de 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT) y visualizadas como colonias azules en presencia de X-gal. Porque el potente Gal4 de la levadura se utiliza AD, Y1H ensayos pueden detectar interacciones con activadores transcripcionales como represores. Además, dado que TF-presas se expresan de un promotor fuerte levadura (ADH1), las interacciones pueden ser detectadas incluso para TFs que tienen niveles de baja expresión endógena, que son difíciles de detectar por ChIP11,12.
Más publicados protocolos para la realización de ensayos de Y1H se basan en introducir TF-presas en el cebo de ADN de levaduras transformando agrupadas bibliotecas TF-presa seguidas por la selección, Colonia selección y secuenciación para identificar la interacción TF, o por transformación de los clones de8,9. Estos son protocolos de tiempo, limitando el número de secuencias de ADN que puede ser probado por el investigador. Una reciente mejora de Y1H ensayos, llamado enhanced Y1H (eY1H), ha aumentado espectacularmente el rendimiento del cribado mediante el uso de una plataforma robótica de alta densidad matriz (HDA) para cepas de levadura DNA-cebo con una colección de cepas de levadura cada uno expresando diferentes TF-presa10,13 (figura 1). Estas pantallas emplean un formato 1.536 Colonia que permite probar TFs más humanas por cuadruplicado, usando solamente tres platos. Además, dado que las interacciones de la TF-ADN se prueban en forma pares, este enfoque permite comparar las interacciones entre DNA-cebos (como dos variantes de los nucleótidos) y entre diferentes TFs o TF variantes11,12 ,14.
Usando análisis de eY1H, hemos delineado el humano más grande y elegans de Caenorhabditis TF centrada en el ADN-ADN interacciones redes hasta la fecha. En particular, hemos identificado 2.230 interacciones entre 246 potenciadores del desarrollo humanos y de TFs 28312. Además, hemos empleado eY1H ensayos para descubrir la alteración Unión TF 109 variantes de cubierta un solo nucleótido asociados con enfermedades genéticas tales como malformación del desarrollo, cáncer y trastornos neurológicos. Más recientemente, utilizamos eY1H para delinear una red compuesta por 21.714 interacciones entre 2.576 promotores de genes de C. elegans y 366 TFs11. Esta red fue clave para descubrir el papel funcional de docenas de TFs de C. elegans .
Los protocolos para generar manchas de ADN-bait y evaluar los niveles de actividad de reportero de fondo han sido divulgado a otra parte15,16,17. Aquí, describimos un gasoducto eY1H que puede utilizarse para cualquier región de ADN genómico humano contra una amplia gama de 1.086 TFs humanas. Una vez que se genera una levadura cepa de ADN-cebo y una matriz de TF-presa es descubierta en las placas correspondientes, el conjunto del Protocolo puede realizarse en dos semanas (cuadro 1). Lo más importante, el protocolo puede ser paralela para que un investigador solo puede pantalla 60 secuencias de ADN-cebo. Para demostrar el protocolo, defendimos a los promotores de los dos genes de citoquinas CCL15 y IL17F. Además, mostramos resultados de fallido pantallas para ilustrar los tipos de problemas que pueden surgir al realizar ensayos de eY1H y cómo solucionarlos problemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Robótica eY1H acoplamiento proyección lo descrito aquí enormemente aumenta el rendimiento para identificar el conjunto de TFs que se unen a una región de ADN de interés, en comparación con la anterior proyección de biblioteca o proyección vestida enfoques basados en transformación. Además, las interacciones de la TF-DNA detectadas por eY1H ensayos son altamente reproducibles como el 90% de las interacciones detectadas positivas para todas las cuatro colonias probados por TF, y 90% de las interacciones vuelva a …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [R35-GM128625 a J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
Riferimenti
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