شاشات الهجين واحد الخميرة المحسنة لتحديد عامل النسخ ملزمة لتسلسل الحمض النووي البشري
Summary
نقدم هنا، تعزيز خميرة مختلطة واحدة فحص بروتوكول لتحديد عوامل النسخ (TFs) التي يمكن أن تربط إلى منطقة الحامض النووي البشري من الفائدة. هذا الأسلوب يستخدم خط أنابيب فرز الفائق الذي يمكن استجواب الربط > TFs 1,000 في تجربة واحدة.
Abstract
تحديد مجموعات عوامل النسخ (TFs) التي تنظم كل الجينات البشرية هو مهمة شاقة تتطلب إدماج العديد من النهج التجريبي والحسابية. أحد هذه الأساليب هو الإنزيم (Y1H) واحد-الهجين الخميرة، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام الجينات مراسل. فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: ‘الحمض النووي-طعم’ (.على سبيل المثال، والمروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و ‘TF-فريسة،’ التي يمكن فحصها لتنشيط الجينات مراسل. وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لأداء شاشات Y1H تحويل مكتبات TF-فريسة أو صفائف إلى سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي. هنا، يمكننا وصف خط أنابيب، ودعا Y1H المحسن (eY1H) فحوصات، حيث استجوبه التفاعلات الحمض النووي TF تزاوج سلالات الطعم الحامض النووي مع مجموعة أراييد من سلالات فريسة TF استخدام صفيف عالية كثافة منصة الروبوتية (HDA) أن يسمح للفحص في 1,536 تنسيق مستعمرة. وهذا يسمح بزيادة كبيرة في الإنتاجية (60 تسلسل الحمض النووي-الطعم ضد > 1,000 TFs تستغرق أسبوعين كل باحث) وإمكانية تكرار نتائج. نحن توضيح أنواع مختلفة من النتائج المتوقعة عن طريق اختبار تسلسل المروج البشرية ضد صفيف TFs البشرية 1,086، فضلا عن أمثلة للمسائل التي يمكن أن تنشأ من خلال الشاشات وكيفية استكشاف أخطاء وإصلاحها لهم.
Introduction
مشكلة مركزية في مجال الطب الحيوي هو تحديد الآليات التي تنظم كل الجينات البشرية. النسخ هو الخطوة الأولى في السيطرة على مستويات التعبير الجيني، وأنه يخضع لمجموعات من عوامل النسخ (TFs) التي تكون فريدة لكل الجينات. ونظرا لأن البشر ترميز > 1,500 TFs1،2، تحديد مجموعة كاملة من TFs التي تتحكم في التعبير عن كل الجينات لا يزال يشكل تحديا مفتوحاً.
يمكن استخدام نوعين من أساليب لخريطة التفاعلات الحمض النووي TF: أساليب محورها TF وتتمحور حول الحمض النووي3 (الشكل 1A). في أساليب محورها TF، يتم سبر TF الاهتمام لربط المجينية الحمض النووي المناطق أو تحديد خصوصيته ربط الحمض النووي. وتشمل هذه الأساليب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) متبوعاً بالتسلسل الفائق والبروتين ملزمة [ميكروارس] سيليكس4،،من56. في أساليب تتمحور حول الحمض النووي، هو سبر تسلسل الحمض النووي من الفائدة لتحديد مجموعة TFs ربط تسلسل الحمض النووي. على أوسع نطاق تطبيق هذه الأساليب هو الخميرة مختلطة واحدة فحوصات (Y1H)، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام مراسل الجينات7،،من89.
فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: ‘الحمض النووي-طعم’ (مثلاً المروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و ‘TF-فريسة،’ التي يمكن فحصها لمراسل الجينات التنشيط9،10 (الشكل 1B). هو استنساخ الحمض النووي-الطعم المنبع مراسل اثنين تتكامل الجينات (لاكز و HIS3) وكل بنيات bait::reporter الحمض النووي في جينوم الخميرة لتوليد تشروماتينيزيد ‘سلالات الطعم الحامض النووي’. يتم إدخال TF الفريسة، ترميز في بلازميد يعبر عن TF تنصهر إلى مجال التنشيط (AD) من الخميرة TF Gal4، في سلالة الحمض النووي-الطعم لصيد السمك للتفاعلات TF-الحمض النووي. إذا كان يربط TF-الفريسة لتسلسل الحمض النووي-الطعم، ثم الإعلان الحالي في TF-الفريسة سيؤدي إلى تفعيل كلا الجينات مراسل. نتيجة لذلك يمكن المحددة للنمو في اللوحات التي تفتقر إلى الحامض الأميني، فضلا عن التغلب على مثبط تنافسي، 3-أمينو-1,2,4-تريازولي (3-ات)، الخلايا مع تفاعل إيجابي وتصور كمستعمرات الأزرق حضور X-غال. لأن الخميرة قوية Gal4 يستخدم الإعلانية، وفحوصات Y1H يمكن الكشف عن التفاعلات التي تنطوي على تفعيل النسخي، فضلا عن ريبريسورس. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن يتم التعبير عن TF يفترس من مروج خميرة قوية (ADH1)، ويمكن الكشف عن التفاعلات حتى بالنسبة TFs التي لديها مستويات منخفضة من التعبير الذاتية، التي تشكل تحديا للكشف عن طريق رقاقة11،12.
وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لإجراء فحوصات Y1H إدخال سلالات الحمض النووي-الطعم الخميرة يفترس TF بتحويل مكتبات فريسة TF المجمعة متبوعاً بالتحديد ومستعمرة الانتقاء والتسلسل لتحديد TF متفاعلة فيما بينها، أو تحويل كل استنساخ8،9. هذه هي بروتوكولات تستغرق وقتاً طويلاً، مما يحد من العدد تسلسل الحمض النووي التي يمكن أن يكون اختبار كل باحث. عزز تحسن الذي حدث مؤخرا لفحوصات Y1H، تسمى Y1H (eY1H)، زاد زيادة كبيرة الإنتاجية الفحص باستخدام منصة روبوتية صفيف (HDA) كثافة عالية لرفيقه سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي مع مجموعة من سلالات الخميرة كل التعبير عن مختلف TF-فريسة10،13 (الشكل 1). تستخدم هذه الشاشات تنسيق مستعمرة 1,536 السماح لاختبار TFs معظم البشرية في البيلوروسية استخدام لوحات ثلاثة فقط. علاوة على ذلك، ونظرا لأن اختبار الحمض النووي TF التفاعلات بطريقة عشوائية ويسمح هذا النهج بمقارنة التفاعلات بين الحمض النووي-الطعوم (مثل الخيارين فضله النوكليوتيدات واحدة) وبين TFs مختلفة أو TF متغيرات11،12 ،14.
استخدام فحوصات eY1H، نحن قد تتحدد بالإنسان أكبر و ايليجانس كاينورهابديتيس TF تتمحور حول الحمض النووي-DNA التفاعلات الشبكات إلى تاريخ. على وجه الخصوص، قمنا بتحديد 2,230 التفاعلات بين القدرة على التنمية البشرية 246 و 283 TFs12. علاوة على ذلك، لقد استخدمنا eY1H فحوصات للكشف عن تغيير الربط TF إلى 109 النوكليوتيدات واحدة فضله المتغيرات المرتبطة بالأمراض الوراثية مثل تشوه التنموية، والسرطان، والاضطرابات العصبية. في الآونة الأخيرة، كنا eY1H تحدد شبكة تتألف من 21,714 التفاعلات بين مروجي الجينات C. ايليجانس 2,576 و 366 TFs11. وكان هذه الشبكة مفيدة للكشف عن الدور الوظيفي لعشرات من TFs C. ايليجانس .
البروتوكولات لتوليد بقع الحمض النووي-الطعم وتقييم مستويات النشاط مراسل الخلفية قد ذكرت في مكان آخر من15،،من1617. وهنا يصف لنا خط أنابيب eY1H التي يمكن استخدامها لفحص أي منطقة الحمض النووي الجينوم البشري ضد مجموعة من 1,086 TFs البشرية. حالما يتم إنشاؤها من خميرة سلالة الحمض النووي-الطعم ورصدت مجموعة TF-فريسة على لوحات المقابلة، يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في الأسبوعين الماضيين (الجدول 1). الأهم من ذلك، يمكن أن باراليليزيد البروتوكول حيث أن باحث واحد يمكن أن الشاشة 60 تسلسل الحمض النووي-الطعم في وقت واحد. وللتدليل على البروتوكول، ونحن فحص المروجين لاثنين من الجينات سيتوكين CCL15 و IL17F. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض النتائج من شاشات الفاشلة لتوضيح أنواع المشاكل التي قد تنشأ عند إجراء فحوصات eY1H وكيفية استكشاف لهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
EY1H الروبوتية التزاوج فحص النهج الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من سرعة النقل لتحديد المجموعة TFs التي تربط منطقة الحمض النووي من اهتمام، مقارنة بفحص المكتبة السابقة أو الفرز صفت النهج القائمة على التحول. علاوة على ذلك، التفاعلات الحمض النووي TF الكشف عنها بواسطة eY1H فحوصات يتم استنساخه بدرجة ع…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” [R35-GM128625 على J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
Riferimenti
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
