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Biochimica

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Published: February 21, 2019
doi:
10.3791/59111
,
1Biozentrum,University of Basel

Summary

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

수송 단백질은 골을 넘어 셀 표면에서 막의 항상성, 세포 기관이 정체성과 생리학에 대 한 필수적입니다. 공부 하 고 퇴행 성 단백질 트래픽, 최근 고정 및 라이브 셀 이미징, 전자 현미경, 또는 화학적 여 골 복잡 한 세포 표면에서 수송 분석을 다양 한 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. 우리 설계 기능성된 안티 녹색 형광 단백질 (GFP) nanobodies-작고, 단위체, 높은 선호도 단백질 바인더-셀 라인 막 단백질 extracellular GFP moiety와 관심의 표현에 적용 될 수 있는. Derivatized nanobodies GFP 기자에 바인딩된 특별히 내 면 고 기자 정렬 경로 따라 피기백을 수송. Nanobodies은 기능성을 형광 현미경 검사 법에 의해 역행 수송을 따라 하는데 과산화 효소 2 전자에 의해 기자 nanobody 복합물의 ultrastructural 지역화를 조사 (APEX2)와 영상 살 fluorophores와 현미경 검사 법, 그리고 trans Golgi 네트워크 (TGN) 도착의 활동을 평가 하기 위해 티로신 sulfation (TS) 모티브. 이 방법론 문서에서는, 우리는 bacterially 표현 하 고 기능성된 nanobodies 정화 일반 절차 개요. 우리는 mCherry 및 TS 수정 nanobodies endocytic 통풍 관 및 TGN 도착 화물 단백질의 분석을 사용 하 여 우리의 도구를 사용 하 여를 강력한를 보여줍니다.

Introduction

단백질과 지질 세포 표면에서 다양 한 세포내 구획을의 역행 트래픽이 막 항상성 분 비를 균형 잡히게 하 고 참가자 전송 기계1 의 구성 요소를 재활용의 유지 보수에 대 한 중요 한 , 2. 다음 clathrin-또는-독립적인 endocytosis 통해 국제화, 단백질 및 지질 화물은 먼저 일찍 채울 endosomes 어디에서 그들은 더 중 엔 lysosomal 시스템, 플라즈마 막에 재활용 따라 리디렉션 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN) 대상. 다양 한 양이온 종속 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CDMPR 및 CIMPR) 등 참가자 막 횡단 화물 수용 체의 기능 사이클의 일부인는 TGN endosomes 및 셀 표면에서 재활용 제공 새로 합성 늦은 endosomes와 리소좀3,,45, sortilin 및 SorLA6,7, 및 Wntless (WLS) 수송 하는 세포 표면에 Wnt ligands는 TGN에서 lysosomal hydrolases 8 , 9 , 10 , 11. 다시는 TGN에 검색 하는 다른 단백질은 TGN46 및 그것의 관련된 isoforms12,13,14, SNAREs (수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 퓨전 요소 첨부 수용 체) 15 , 16 , 17, 녹말 체 선구자 단백질 (APP)18,19, 진보적인 ankylosis (ANK) 단백질20, ATP7A/B 나 DMT121,22, 등 고 막 횡단 금속 전송기 효소 carboxypeptidase D, furin 또는 BACE123,,2425를 포함 하 여 처리. 이러한 내 생 단백질은 그렇다 하 고 박테리아 및 식물 독 소 (예를 들어, 시가 콜레라 독 소, 신은 abrin) 납치 cytosol26,27,에 retrotranslocation에 대 한 응급실에 도달 역행 수송 기계 , 2829.

직접 역행 트래픽 분석, 위해 이전 레이블 및 세포내 구획30화물 단백질을 세포 표면에서 따라 하는 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. Nanobodies는 homodimeric 무거운 체인만 항 체 (hcAbs) camelids과 연골 물고기31,32에서 자연스럽 게 발생 하는에서 파생 된 단백질 바인더의 새로운 가족을 나타냅니다. 그들은 hcAbs의 변수 중 체인 도메인 (VHH)를 구성 하 고 기존의 항 체 (예: IgGs)에 비해 많은 장점이 있다: 그들은 단위체, 작은 (~ 15 kDa), 높은 가용성, 이황화 결합, 없는 bacterially 표현 하 고 선정 수 높은 친 화력 바인딩33,,3435,36. 우리의 nanobody 도구를 다양 하 고 광범위 하 게 적용을 하려면 우리는 표면 레이블과 트랙 단백질 그들의 세포 외/lumenal 도메인에서 GFP 태그로 기능성된 안티-GFP nanobodies 고용. MCherry, 하는데 과산화 효소 2와 nanobodies (APEX2)의 기능화에 의해37또는 티로신 sulfation (TS) 시퀀스, 역행 bonafide 막 횡단 화물 단백질의 고정으로 분석 될 수 있다 수송과 라이브 셀 이미징 전자 현미경 검사 법, 또는 화학적. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 및 TPST2)에 의해 중재 티로신 sulfation 이기 때문에 trans Golgi 제한 posttranslational 수정/TGN, 우리 수 있다 직접 전송 하 고이 셀 표면에서 관심사의 단백질의 활동 세포내 Golgi 구획38,,3940.

이 방법 문서에서는, 우리는 포유류 세포30의 역행 교통 분석 응용 프로그램의 수에 적합 한 기능성된 nanobodies (VHH-2xTS,-APEX2,-mCherry 및 파생 상품)의 생산의 용이성을 설명 합니다. 우리는 주로 sulfation의 세포 표면에서 세포내 매매의 분석에 대 한 TS 사이트 수정 nanobody의 사용에 초점.

Protocol

1. 세균성 전이 기능성된 Nanobodies 참고: 이 프로토콜은 앞에서 설명한30식, 정화, 고 기능성된 안티-GFP nanobodies의 분석에 대 한 최적화 되었습니다. 다른 단백질 moieties와 derivatization이 표준 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다. 해 동 chemocompetent 박테리아 (~ 100 µ L) 단백질 표정에 적합 (예를 들면, 대장균 로제타 BL21 (DE3) 셀) 얼음에…

Representative Results

다양 한 세포내 목적지 역행 단백질 교통 조사, 우리는 최근 레이블 및 셀 표면30에서 재조합 융합 단백질을 따라 하는 안티-GFP nanobody 기반 도구를 설립 했습니다. 여기, 그러한 세균 생산 nanobodies derivatized 그리고 TGN 도착 sulfation 분석 조사를 그들의 사용 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법 및 immunoblotting, endocytic 통풍 관 공부를 그들의 응용 프로그램을 보?…

Discussion

Nanobodies 많은 이점이 기존의 항 체와 단백질 바인더 장비의 신흥 클래스 대표: 그들은 작은, 안정, 단위체, 높은 친 화력과 부족 이황화 채권33,35, 에 선정 될 수 있다 44 , 45. 세포 배양 시스템에 유기 체 개발 생물학46,47,48,<s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 그랜트 31003A-162643 스위스 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다. 우리 니콜 Beuret는 Biozentrum 이미징 핵심 시설 (IMCF) 지원에 대 한 감사합니다.

Materials

Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1 x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50 x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100 x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35-mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M
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Riferimenti

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Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).
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