Singel-genomströmning kompletterande högupplösta analysmetoder för kännetecknar komplexa naturliga organiska ämnen blandningar

Globalt, beräknas våtmarker innehålla 529 Pg av kol (C), mestadels som ekologisk C begravd i torv insättningar¹. För närvarande fungerar sådana torvmarker som C nettosänka, komplexbildare 29 Tg C y^-1 i Nordamerika ensam¹. Dock miljöstörningar såsom dränering, bränder, torka och varmare temperaturer kan kompensera denna C sjunka genom att öka organiskt nedbrytning vilket resulterar i ökad C förluster via växthusgaser (koldioxid [CO₂] och metan [CH₄]) produktion^1,2. Klimatförändringar kan bidra till C förlust om varmare temperaturer eller torktumlare villkor stimulerar snabbare C nedbrytning av mikroorganismer. Alternativt, högre temperaturer och luften CO₂ koncentrationer kan stimulera primära produktionen för att binda mer CO₂ som organiskt kol (OC). I vilken utsträckning och hur snabbt det OC bryts sedan in CO₂ och CH₄ beror på de komplexa interaktioner mellan de elektron donator substratesna, tillgången på Elektronacceptorer och de mikroorganismer som medla den omvandling. I många fall mekanismerna är inte välkarakteriserad, således deras svar på miljömässiga störningar är inte väl begränsade och det är fortfarande oklart hur resultatet av klimatförändringarna kommer att påverka kolbalans i torvmark ekosystem.

Den komplicerade karaktären av naturligt organiskt material (NOM) har gjort att även identifiera de organiska föreningarna som finns i NOM blandningarna historiskt svårt. Senaste framsteg har kraftigt förbättrat vår förmåga att karakterisera föreningar som traditionellt och, i viss utsträckning fortsätta att betraktas som motsträviga humus eller fulvic föreningar^3,4,5. Nu förstår vi att många av dessa föreningar är faktiskt mikrobiellt tillgänglig och kan brytas om en lämplig terminal Elektronacceptor (TEA) görs tillgänglig^6,7. Beräkna det nominella oxidationstillståndet av kol (NOSC) förening ger ett mätvärde för att förutsäga risken för nedbrytning och av te krävs energiutbyte. Det kräver dock en molekylnivå karakterisering av organiskt material⁷. NOSC beräknas från molekylformel via följande ekvation⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, där z är nettoladdningen. NOSC är korrelerad med den termodynamiska drivande kraft⁸, vari föreningar med högre NOSC är lättare att bryta ned, medan föreningar med lägre NOSC kräver allt mer energisk teer för att minskas. Föreningar med NOSC mindre än −2 kräver en hög energi ger teer såsom O₂, nitrat eller Mn^IV, och kan inte brytas ned av vanligt förekommande lägre energi ger teer såsom Fe^III eller sulfat⁷. Detta är en viktig faktor i vattendränkt syrefria förhållanden i våtmarker där O₂ och andra hög energi ger teer är knappa⁹ och nedbrytningen av lägre NOSC föreningar under dessa förhållanden är därför thermodynamically begränsad. Miljömässiga störning kan påverka ekosystemet genom hydrologiska förändringar som påverkar O₂ (den mest energiska Elektronacceptor), förändringar i organiskt substrat och Elektronacceptorer tillgängliga termodynamiska tillstånd av primär produktion, och i mindre utsträckning av temperatur. Ett viktigt exempel temperatur effekter i våtmark system uppstår när det gäller avvägningen som uppstår mellan homoacetogenesis (dvs, acetat produktion från CO₂ och H₂) och hydrogenotrophic () methanogenesis dvs, CH₄ produktion från CO₂ och H₂). Vid låga temperaturer verkar det homoacetogenesis något gynnas, medan varmare temperaturer gynnar CH₄ produktion¹⁰. Denna temperatur effekt kan få viktiga konsekvenser för svar av ekosystem till förändrade klimat, som CH₄ är en mycket starkare växthusgas än CO₂¹¹ och därmed ökande produktion av CH₄ på bekostnad av CO₂ vid varmare temperaturer kan bidra till en positiv feedback med klimatuppvärmningen.

Torvmarker producera globalt betydande mängder CO₂ och CH₄⁶via mikrobiell respiration av naturligt förekommande organiska materia. NOSC av de organiskt kol substratesna bestämmer den relativa andelen CO₂: CH₄ produceras som är en kritisk parameter på grund av den högre strålnings tvinga CH₄ jämfört med CO₂¹¹, men också eftersom modellering ansträngningar har identifierat detta förhållande som en kritisk parameter för att uppskatta C flux i torvmarker¹². I avsaknad av terminal Elektronacceptorer än CO₂, det kan visas av elektron balans att organiska C substrat med NOSC > 0 kommer producera CO₂: CH₄ > 1, ekologisk C med NOSC = 0 producerar CO₂ och CH₄ i equimolar ratio och organiska C med NOSC < 1 kommer att producera CO₂: CH₄ < 1¹³. Nedbrytning av OC i naturliga ekosystem medieras av mikroorganismer, så att även när nedbrytning av en särskild förening är thermodynamically genomförbart, det är kinetiskt begränsas av aktiviteten av mikrobiella enzymer och under syrefria förhållanden, genom den termodynamiska drivkraft (dvsNOSC)⁷. Tills nu har det varit en utmaning att fullt karakterisera organiskt material eftersom mångfalden av föreningar som finns kräver olika kompletterande tekniker för deras karakterisering. Senaste framstegen har minskat gapet; med hjälp av en uppsättning analytiska tekniker kan vi analysera ett stort utbud av organiska föreningar som tillhandahåller molekylnivå karakterisering och, i vissa fall kvantifiering, från små primära metaboliter som glukos upp till 800 Da poly-föreningar. Tidigare skulle sådana stora komplexa molekyler ha präglats helt enkelt som lignin-liknande eller tannin-liknande och antas ha varit motsträviga. Molekylär nivå karakterisering, tillåter dock beräkningen av NOSC för även dessa stora komplexa molekyler. Dessa NOSC värden är linjärt korrelerade med de termodynamiska drivkraft som möjliggör en bedömning av kvaliteten på organiskt material tillgängligt för nedbrytning, som i många fall avslöjar att dessa komplexa molekyler kan faktiskt vara mikrobiellt nedbrytbara även under syrefria förhållanden som råder i våtmarker.

Eftersom införandet av O₂ tillåter organiskt material av nästan alla naturligt observerade NOSC värden att brytas, fokuserar häri vi på förändringar i organiskt material och mikrobiell proteomik som sannolikt är de främsta drivkrafterna i våtmark (dvs. begränsade O₂) system. Alla de tekniker som vi kommer att diskutera kan dock tillämpas på organiskt material från alla ekosystem. Vanligen, bulk mätningar baserat på optisk och fluorescens analyser har använts för att bedöma organiskt material kvalitet^3,14. När du använder bulk mätningar som dessa, men går fina detaljer förlorade som ett stort antal molekyler kategoriseras tillsammans under generiska termer som humics eller fulvics. Definitionerna av dessa kategorier är inte väl begränsade och, i själva verket kan variera från studie till studie gör jämförelser omöjligt. Ytterligare, bulk mätningar inte ger de molekylära uppgifter som är nödvändiga för beräkning av termodynamiken styr systemet och därför inte når att verkligen bedöma organiskt material kvalitet¹⁵.

Enskilda tekniker såsom Fourier transform ion cyclotron resonance masspektrometri (FTICR-MS), kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, gaskromatografi massa masspektrometri (GC-MS) och vätskekromatografi masspektrometri (LC-MS) gör tillhandahålla sådan molekylär nivå detalj. Medan var och en av dessa tekniker presenterar sina egna begränsningar, föra de också sina egna styrkor som kan utnyttjas i en integrerad strategi att uppnå på molekylär detaljnivå som krävs för att kvantifiera organiskt material kvalitet i en rigorös termodynamisk mening . GC-MS är användbara för att identifiera kritiska små metaboliter som sannolikt kommer att påverka proximala CO₂ och CH₄ produktion (t.ex., glukos, acetat, etc.); dock GC-MS kräver verifiering mot en standard och är därför begränsad till redan kända föreningar som finns i databasen att förhindra identifiering av nya föreningar. GC-MS är dessutom en semi kvalitativa teknik tillåter inferens om förändringar i relativa koncentrationer, men som inte tillhandahåller den faktiska koncentration informationen som behövs för att beräkna Gibbs fria energi till exempel. Slutligen, GC-MS kräver derivatisering av molekyler före analys som begränsar upplösning för föreningar som är mindre än ~ 400 Da och flyktiga alkoholer förloras under torkning steg.

Endimensionell (1D) ¹H flytande tillstånd NMR tillåter mycket kvantitativa karakterisering av små metaboliter (inklusive primära små molekylvikt metaboliter och flyktiga ämnen som alkoholer, acetat, aceton, formate, pyruvat, succinat, kortkedjade fettsyror, liksom en rad kolhydrater notoriskt frånvarande eller komprometterad från MS-baserade metoder) och deras koncentrationer är särskilt användbara för beräkning av termodynamiska parametrar. Men som GC-MS, 1D NMR av komplexa blandningar kräver standardisering i förhållande till en databas och därför ensam tillåter inte enkel identifiering av nya föreningar som kan förväntas vara rikligt i komplexa naturliga och föränderliga ekosystem. Dessutom NMR är mindre känsligt än de MS-baserade teknikerna och därför kvantitativa metabolit profilering uppnås endast över 1 µM med hjälp av NMR system utrustade med helium-cooled kalla-sonder. Inte uppskattad, vissa NMR kalla-prober är salt-toleranta och möjliggöra miljömässiga blandning analys i närvaro av millimolar salt koncentrationerna när den används i mindre diameter (< 3 mm ytterdiameter) prov rör¹⁶. Ytterligare en komplikation av NMR är dock att stora mängder paramagnetiska metaller och mineraler (t.ex., Fe och Mn över 1-3 wt %), som kan vara rikligt i höglänta jordar, kan bredda spektrala funktioner och komplicerar tolkningen av NMR spectrana . Med fasta fasen extraktion (SPE) kan medhjälpare i tolkningen av både NMR- och MS-baserad metabolomik metoder genom att minska mineralsalter och ökande spektrala kvalitet.

FTICR-MS genom direkt injektion är en mycket känslig teknik som kan detektera tiotusentals av metaboliter från ett enda prov, men det har inte fånga de kritiska små metaboliterna som acetat, pyruvat och succinat och är notoriskt svårt att för socker och andra kolhydrater¹⁷, inte heller ger kvantitativ information. Men till skillnad från andra tekniker, FTICR-MS utmärker på att identifiera och tilldela nya föreningar molekylformel och därför identifierar det största antalet föreningar som ger mer molekylär information än någon av de andra beskrivna teknikerna. Detta är användbart eftersom molekylär uppgifter från FTICR-MS (och andra tekniker) kan användas för att beräkna NOSC som är relaterad till den termodynamiska drivkraften som styr sannolikheten för vissa reaktioner⁸ och deras priser under vissa villkor⁷. Dessutom av koppling FTICR-MS med separation tekniker, såsom LC tillsammans med tandem MS, kan kvantitativa strukturella uppgifter uppnås, kvittning några av nackdelarna med denna teknik. LC-MS är användbart för att identifiera lipid-liknande föreningar och andra metaboliter som inte är väl kännetecknas av någon av de andra metoderna. Koppling LC FTICR-MS eller LC-MS med en bråkdel samlare och samla fraktioner av specifika okända sevärdheter för strukturella klarläggande av tvådimensionella (2D) flytande tillstånd NMR är den idealiska situationen för att identifiera och kvantifiera okänd föreningar^{18 ,19}. Detta är dock ett mycket tidskrävande steg som kan användas om och när det behövs. Tagit individuellt, var och en av dessa tekniker ger en olika ögonblicksbild av organiskt material och genom att integrera dem, vi kan uppnå en mer fullständig förståelse än att använda någon av teknikerna i isolering.

Medan de termodynamiska övervägandena anges de ultimata begränsningarna på vilka förändringar är möjliga i ett system, medieras organiskt nedbrytning av mikroorganismer vars Enzymaktiviteter styra reaktion priser. Således helt förstå kontrollerna på nedbrytning av organiskt material och slutligen växthus gas (CO₂ och CH₄) produktion från våtmarker kräver ett integrerat omics förhållningssätt till karaktärisera de mikrobiella Enzymaktiviteter samt metaboliterna. I den här artikeln beskriver vi en metod för att uppnå en sådan omfattande analys från ett prov med en sekventiell metod som resulterar i en helt ihopkopplade analys. Detta synsätt expanderar på metabolit, protein och lipid utvinning (MPLex) protokoll där proteomik var förenat med GC-MS och LC-MS²⁰ för att identifiera små metaboliter, proteiner och lipider genom att införliva kvantitativa metaboliten via NMR och identifiering av större sekundära metaboliter via FTICR-MS. något olika till MPLex, vi börjar i protokollet med en vatten extraktion och sedan använda sekventiell extraktion med allt icke-polära lösningsmedel. Alla extraktioner görs på ett enda prov som sparar prov när volymerna är begränsad eller svårt att få och minskar experimentella fel infördes genom variation bland alikvoter från heterogena provmatriser (t.ex., jord och torv) eller skillnader i villkor för förvaring och varaktighet.

Slutligen, genom koppling OM analyserna med proteomik analys av mikrobiell gemenskapen, kan vi bygga metaboliska nätverk som beskriver vägar och omvandling av organiskt material nedbrytning. Detta tillåter oss att testa specifika hypoteser om hur störningar i systemet kommer att påverka ultimate CO₂ och CH₄ produktion genom ändring av de tillgängliga organiska substratesna, Elektronacceptorer och de mikrobiella samhällena medla den reaktioner via aktiviteten av enzymet katalysatorer.

Det övergripande målet med denna metod är att ge ett enda genomströmning protokoll för att analysera metaboliter, lipider och mikrobiell proteiner från ett enda prov som därmed skapar en helt ihopkopplade datamängd för att bygga metaboliska nätverk medan begränsande analytiska fel .