Сингл-пропускная способность взаимодополняющих разрешением аналитические методы характеризующие сложных природных органических веществ смеси

Глобально водно-болотных угодий оценкам содержат 529 Pg углерода (C), главным образом органического углерода, похоронен в торфяных месторождений¹. В настоящее время такие торфяники действовать как чистая раковина C, улавливание 29 Tg C y^-1 в Северной Америке только¹. Однако экологические нарушения таких слив, пожары, засухи и повышение температуры может компенсировать это раковина C путем увеличения разложение органических веществ, что приводит к увеличению потерь через C парниковых газов (диоксид углерода [CO₂] и ^1,производство метана [CH₄])². Изменение климата может способствовать потере C Если повышение температуры или сушка условий стимулирования быстрее C разложение микроорганизмами. Кроме того более высокие температуры и концентрации в воздухе CO₂ может стимулировать первичного производства улавливания больше CO₂ в качестве органического углерода (ОУ). В какой степени и как быстро что OC затем разложить на CO₂ и CH₄ зависит от сложного взаимодействия между субстратов доноров электронов, доступность акцепторов электронов и микроорганизмы, которые посредником преобразование. Во многих случаях механизмы не являются хорошо изученных, таким образом их реакции на экологические потрясения не хорошо ограниченного и остается неясным, что в результате изменения климата будет на баланс углерода в экосистемы болота.

Сложный характер природных органических веществ (NOM) сделал даже идентификации органических соединений, присутствующих в исторически трудных NOM-смеси. Последние достижения значительно улучшили нашу способность, традиционно характеризуют соединений и, в определенной степени по-прежнему рассматриваться как непокорных гуминовых фульвовых соединений^3,,4или⁵. Теперь мы понимаем, что многие из этих соединений фактически микробиологически доступен и может быть разложено, если подходящий терминал электрон акцептора (чай) производится доступны^6,7. Расчет номинального окисления углерода (NOSC) для соединения предоставляет метрики для прогнозирования потенциал для разложения и выход энергии требуется чая. Однако это требует молекулярном уровне характеристика органических веществ⁷. NOSC рассчитывается от Молекулярная формула через следующее уравнение⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, где z — Чистая бесплатно. NOSC коррелирует с термодинамических движущей силой⁸, которой соединений с более высокой NOSC легче деградируют, хотя соединений с Нижняя NOSC требуют более энергичных чаи для того, чтобы быть сокращены. Соединения с NOSC менее чем −2 требуют высокой энергии, уступая чаи как O₂, нитрат или Mn^IVи не должно ухудшаться часто встречающихся меньше энергии, уступая чаи, такие как Fe^III или сернокислый⁷. Это является важным фактором в заболоченных анаэробных условиях в водно-болотных угодий, где O₂ и других высоких энергий, уступая чаи являются скудными⁹ и, следовательно, ухудшение состояния нижней NOSC соединений в этих условиях термодинамически ограничены. Экологические возмущений могут влиять термодинамического состояния экосистемы через гидрологических изменений, которые влияют O₂ (наиболее энергичных акцептора электронов), изменения в органических субстратов и акцепторов электронов, доступны на начальной производство и в меньшей степени температуры. Важным примером температурных эффектов в водно-болотных угодий системах происходит в отношении компромисса, который происходит между homoacetogenesis (то есть, ацетат производство с CO₂ и Ч.₂) и hydrogenotrophic (при этом освобождается метан то есть, CH₄ производства с CO₂ и Ч.₂). При низких температурах он кажется что homoacetogenesis слегка выступает, в то время как потепление пользу CH₄ производства¹⁰. Этот эффект температуры могут иметь важные последствия для реакции экосистем к изменению климата, как CH₄ является парниковым газом гораздо сильнее, чем CO₂¹¹ и, следовательно, увеличения производства CH₄ на счет по CO₂ при повышенной температуре может способствовать положительной обратной связи с потеплением климата.

Болот производят глобально значительное количество CO₂ и CH₄⁶через микробной дыхание естественным органическим вопрос. NOSC субстраты органического углерода определяет относительную долю CO₂: CH₄ производства, который является критическим параметром из-за более высоких радиационное CH₄ по сравнению с CO₂¹¹, но и потому, что Моделирование усилия определили это соотношение как критический параметр для оценки потока C в торфяниках¹². В отсутствие акцепторов электронов терминала помимо CO₂, он может быть отображено электрона баланс органических субстратов C с NOSC > 0 будет производить CO₂: CH₄ > 1, органического углерода с NOSC = 0 производит CO₂ и CH₄ в эквимолярных соотношение и органического углерода с NOSC < 1 будет производить CO₂: CH₄ < 1¹³. Разложение OC в природных экосистемах опосредовано микроорганизмов, так что даже когда деградация конкретного соединения термодинамически возможна, она кинетически ограничивается деятельность микробных ферментов и в анаэробных условиях, по термодинамические движущей силы (т.е., NOSC)⁷. До сих пор сложно полностью характеризуют органического вещества, потому что разнообразие составляющих требует различных дополнительных методов для их описания. Последние достижения закрыли этот разрыв; с помощью набора аналитических методов мы можем анализировать большой ассортимент органических соединений, обеспечивая молекулярном уровне квалификации и, в некоторых случаях количественной оценки, от небольших первичных метаболитов как глюкозы до 800 да поли гетероциклов. Ранее такие большие сложные молекулы бы характеризуются просто как лигнин как или танин как и предполагаемой были непокорных. Характеристика молекулярно уровня, однако, позволяет расчета NOSC даже этих больших сложных молекул. Эти значения NOSC линейно коррелируют с термодинамическим движущей силой, позволяя для оценки качества органических веществ для разложения, которые во многих случаях показывает, что эти сложные молекулы фактически может быть микробиологически разложению даже в анаэробных условиях, которые преобладают в водно-болотных угодий.

Поскольку введение O₂ позволяет органического вещества почти все естественно наблюдаемых значений NOSC чтобы разложить, здесь мы сосредоточиться на изменения в органических веществ и микроорганизмов протеомики, которые, скорее всего быть основными причинами в водно-болотных угодий (т.е., ограниченное O₂) систем. Однако все методы, которые мы будем обсуждать может применяться для органического вещества из любой экосистемы. Обычно массовых измерений на основе оптических и флуоресценции анализы были использованы для оценки качества органического вещества^3,14. При использовании массовых измерений такие, однако мелкие детали теряются как большое количество молекул классифицируются вместе под общие термины как гуматы или fulvics. Определения этих категорий не являются хорошо ограничением и в самом деле, могут отличаться от исследования для изучения сравнение невозможно. Кроме того массовых измерений не обеспечивают молекулярных деталях, необходимых для расчета термодинамики, регулирующие системы и поэтому оправдывают поистине оценки качества органических веществ¹⁵.

Отдельные методы, такие как Фурье преобразование ионного циклотронного резонанса масс-спектрометрии (FTICR-MS), спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), газовая хроматография массовые спектрометрии (ГХ-МС) и делать жидкостной хроматографии с масс-спектрометрия (LC-MS) предоставления такого молекулярного уровня детализации. Хотя каждый из этих методов представляет свои собственные ограничения, они также приносят свои сильные стороны, которые могут быть использованы в рамках комплексного подхода для достижения тонкой молекулярных деталях, необходимых для количественной оценки качества органического вещества в строгий термодинамических смысле . GC-MS полезен для выявления критических малых метаболитов, которые, вероятно, проксимальной влияние на CO₂ и CH₄ производства (например, глюкоза, ацетат и т.д.); Однако GC-MS требует проверки против стандарта и поэтому ограничивается уже известных соединений, присутствующих в базе предотвращения идентификации новых соединений. Кроме того GC-MS — полу качественная техника позволяя вывод об изменениях в относительной концентрации, но не предоставляет фактической концентрацией необходимую информацию для вычисления Гиббса свободной энергии, например. Наконец GC-MS требует деривации молекул до анализа, который ограничивает резолюции соединений меньше ~ 400 да и летучих спирты теряются во время сушки шага.

Одномерный (1D) ¹H ЯМР жидкое состояние позволяет высоко количественных характеристик мелких метаболитов (включая первичный небольшой молекулярной массой метаболитов и летучих веществ как спирты, ацетат, ацетон, формате, пируват, сукцинат, короткоцепные жирных кислот, а также широкий спектр углеводов заведомо отсутствует или нарушенной из методов на основе MS) и особенно полезны для вычисления термодинамических параметров их концентрации. Тем не менее как и GC-MS, ЯМР 1D сложных смесей требует стандартизации по отношению к базе данных и поэтому самостоятельно не позволяют легко идентифицировать новых соединений, которые могут быть обильные в сложных природных и изменение экосистем. Кроме того, менее чувствительны, чем MS-методы на основе ЯМР и таким образом, количественные метаболит профилирование достигается только выше 1 мкм с помощью ЯМР систем, оснащенных гелий охлаждаются холодной зондов. Оценил не широко, некоторые холодной ЯМР-зонды солеустойчивое и позволяют проводить анализ экологической смеси в присутствии millimolar концентрация соли при использовании меньшего диаметра (< 3 мм Наружный диаметр) образец трубы¹⁶. Однако, дальнейшее осложнение ЯМР является то, что большое количество парамагнитных металлов и минералов (например, Fe и Mn выше 1-3 wt %), которые могут быть обильные в горных почв, можно расширить спектральные характеристики и усложнить толкование спектров ЯМР . С помощью твердой фазы экстракции (SPE) могут помочь в интерпретации ЯМР и на основе MS метаболомики методы уменьшая минеральных солей и увеличивая спектрального качества.

FTICR-MS путем прямого впрыска чувствительный техника способны обнаруживать десятки тысяч метаболитов от одного образца, но он не захватить критических небольшой метаболитов например ацетат, пируват и сукцината и сложно использовать для сахара и других углеводов¹⁷, и она не обеспечивает количественной информации. Однако в отличие от других методов, FTICR-MS выделяется на определение и назначение Молекулярная формула Роман соединений и таким образом определяет наибольшее количество соединений, обеспечивая более молекулярных информации, чем любой из описанных методов. Это полезно, потому что молекулярные, представленная FTICR-мс (и другие методы) может использоваться для вычисления NOSC, которое связано с термодинамическим движущей силой, управляющих вероятность определенных реакций⁸ и их ставки при определенных ⁷условия. Кроме того путем соединения FTICR-MS с разделение методов, таких как LC вместе с тандем МС, количественные структурная информация может быть достигнуто, компенсировать некоторые из недостатков этого метода. LC-MS полезен для выявления соединений липидов как и другие метаболиты, которые не являются хорошо изученных любым из других методов. Муфта FTICR LC-MS или LC-MS с коллектор фракций и сбора фракций конкретных неизвестных интерес для структурных разяснения двухмерный (2D) жидкого состояния, которую ЯМР-это идеальная ситуация для идентификации и количественного определения неизвестных соединений^{18 ,19}. Однако это очень много времени шаг, который может использоваться при необходимости. Взятые по отдельности, каждый из этих методов предоставляют различные снимок органического вещества, и путем их интеграции, мы можем достичь более полного понимания, чем с помощью любого из методов в изоляции.

В то время как термодинамические вопросы задать конечной ограничения на какие преобразования возможны в системе, разложения органических веществ при посредничестве микроорганизмов, чья деятельность фермента контролировать скорость реакции. Таким образом, полного понимания элементов управления на разложение органического вещества и в конечном итоге парниковых газов (CO₂ и CH₄) производства от водно-болотных угодий требует комплексной омику подхода к характеристике микробной ферментативной активности, а также метаболиты. В этой статье мы описываем метод для достижения такого всеобъемлющего анализа от одного образца, используя последовательный подход, который приводит к полностью парных анализа. Такой подход расширяет метаболит, белков и липидов протокол извлечения (MPLex) в котором протеомики был увязан с GC-MS и LC-MS²⁰ для выявления мелких метаболитов, белки и липиды путем включения количественных метаболит информации через ЯМР и идентификации крупных вторичных метаболитов через FTICR-г-жа слегка отличается от MPLex, мы начинаем протокол с водной вытяжке и затем использование последовательного извлечения с все более неполярных растворителей. Все экстракции производится на один образец, который экономит пример, когда объемы являются ограниченными или трудно получить и уменьшается экспериментальной ошибки представил через различия между аликвоты из гетерогенных образец матрицы (например, почвы и торф) или различия в условиях хранения и продолжительности.

Наконец путем соединения ом анализов с протеомики анализов микробных, мы можем построить метаболических сетей, которые описывают пути и преобразование разложения органического вещества. Это позволяет нам проверить определенных гипотез о влияние возмущений в систему конечной CO₂ и CH₄ производства путем изменения имеющихся органических субстратов, акцепторов электронов и микробных сообществ посредничество по реакции через активность фермента катализаторов.

Общая цель этого метода является предоставить единый пропускной способности протокол для анализа метаболитов, липиды и микробных белков от одного образца, создавая тем самым полностью парных dataset для создания метаболических сетей хотя ограничение анализа ошибок .