Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Wereldwijd, wetlands zijn naar schatting bevatten 529 Pg van koolstof (C), meestal als organische C begraven in turf deposito’s¹. Op dit moment fungeren zo’n veengebieden als een netto C wastafel, vastleggen van 29 Tg C y^-1 in Noord-Amerika alleen al¹. Echter milieu verstoring zoals drainage, branden, droogte en warmere temperaturen deze C-wastafel kan compenseren door het verhogen van de ontleding van organisch materiaal wat resulteert in verhoogde C verliezen via van broeikasgassen (kooldioxide [CO₂] en methaan [CH₄]) productie^1,2. Klimaatverandering kan bijdragen aan C verlies als warmere temperaturen of droger voorwaarden sneller C ontleding door micro-organismen stimuleren. Hogere temperaturen en concentraties in de lucht CO₂ kunnen anderzijds primaire productie te sekwestreren meer CO₂ als organische koolstof (OC) stimuleren. In welke mate en hoe snel dat OC dan is ontleed in CO₂ en CH₄ hangt af van de complexe interacties tussen het elektron donor substraten, de beschikbaarheid van elektronen acceptoren en de micro-organismen die bemiddelen de transformatie. In veel gevallen de mechanismen zijn niet goed gekarakteriseerd, dus hun reactie op milieu verstoringen niet goed gebonden en het blijft onduidelijk wat het netto resultaat van de klimaatverandering zullen op de koolstofbalans in veengebieden ecosystemen.

Het complexe karakter van natuurlijke organische stof (NOM) heeft zelfs het identificeren van de organische stoffen aanwezig in de historisch moeilijke NOM-mengsels. Recente vooruitgang verbeterd ons vermogen om verbindingen dat traditioneel karakteriseren en, tot op zekere hoogte nog steeds worden, beschouwd als recalcitrante humus of fulvo verbindingen^3,4,5sterk. We begrijpen nu dat veel van deze verbindingen eigenlijk microbially beschikbaar zijn en kunnen worden ontleed als een geschikte terminal elektron acceptor (thee) beschikbaar^6,7wordt gemaakt. Berekening van het nominale oxidatiegetal van de koolstof (NOSC) voor een samengestelde biedt een metriek voor het voorspellen van het potentieel voor de ontleding en de energie-opbrengst van de thee vereist. Het vereist echter de karakterisering van een moleculair-niveau van de organische stof-⁷. NOSC is berekend op basis van de molecuulformule via de volgende vergelijking⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, waar z de netto lading is. NOSC is gecorreleerd met de thermodynamische drijvende kracht⁸, waarin stoffen met hogere NOSC gemakkelijker zijn te worden afgebroken, terwijl verbindingen met lagere NOSC steeds meer energieke thee nodig in mindering gebracht. Verbindingen met NOSC, minder dan −2 vereisen een hoge energie opbrengst thee zoals O₂, nitraat of Mn^IV, en kan niet worden gedegradeerd door het algemeen voorkomende lagere energie opbrengst thee zoals Fe^III of sulfaat⁷. Dit is een belangrijke overweging in het vastgereden zuurstofvrije omstandigheden gevonden in wetlands waar O₂ en andere hoge energie opbrengst theeën schaars^{9 zijn} en daarom de afbraak van de lagere NOSC verbindingen onder deze omstandigheden zijn thermodynamisch beperkt. Milieu perturbation invloed kan uitoefenen op de thermodynamische staat van het ecosysteem door hydrologische veranderingen die van invloed zijn O₂ (de meest energieke elektron acceptor), veranderingen in organische substraten en elektronen acceptoren ter beschikking gesteld door primaire productie, en op een kleinere schaal door temperatuur. Een belangrijk voorbeeld van de temperatuureffecten in het wetland systemen optreedt met betrekking tot de trade-off die tussen homoacetogenesis (dat wil zeggen, acetaat productie van CO₂ en H₂) en hydrogenotrophic () methanogenese plaatsvindt dat wil zeggen, CH₄ productie van CO₂ en H₂). Bij lage temperaturen lijkt het dat homoacetogenesis is licht favoriet, terwijl warmere temperaturen CH₄ productie^{10 gunst}. Dit effect van de temperatuur kan belangrijke gevolgen hebben voor de reactie van ecosystemen aan de veranderende klimaat, zoals CH₄ een veel sterker broeikasgas dan CO₂¹¹ en dus toenemende productie van CH,₄ ten koste van is CO₂ bij warmere temperaturen kan bijdragen aan een positieve feedback met het klimaat opwarming van de aarde.

Veengebieden produceren wereldwijd aanzienlijke hoeveelheden van CO₂ en CH₄⁶via microbiële ademhaling van natuurlijk voorkomende biologische materie. De NOSC van de organische koolstof substraten bepaalt het relatieve aandeel van CO₂: CH₄ geproduceerd die een kritieke parameter is vanwege de hogere radiatieve dwingen van CH,₄ vergeleken met CO₂¹¹, maar ook omdat modellering inspanningen hebben deze verhouding geïdentificeerd als een kritieke parameter voor het schatten van C flux in veengebieden¹². Bij gebrek aan terminal elektronen acceptoren dan CO₂, kan worden aangetoond door elektron evenwicht dat biologische C substraten met NOSC > 0 wil CO_{2 produceren}: CH₄ > 1, organische C met NOSC = 0, treedt er CO₂ en CH₄ in mengsel verhouding en organische C met NOSC < 1 CO₂zal produceren: CH₄ < 1¹³. Ontleding van OC in natuurlijke ecosystemen wordt gemedieerd door micro-organismen, zodat zelfs bij afbraak van een specifieke stof thermodynamisch haalbaar is, het kinetisch wordt beperkt door de activiteit van de microbiële enzymen en onder zuurstofvrije omstandigheden, door de thermodynamische motor (d.w.z.NOSC)⁷. Tot op heden heeft het is uitdagend te volledig karakteriseren de organisch materiaal, aangezien de verscheidenheid van verbindingen aanwezig verschillende complementaire technieken voor hun karakterisering vereist. Recente vooruitgang hebben gesloten de kloof; met behulp van een suite van analytische technieken kunnen wij een groot bereik van organische verbindingen verstrekken van karakterisering van moleculaire-niveau en in sommige gevallen kwantificering, van kleine primaire metabolieten zoals glucose tot 800 Da poly-heterocycles analyseren. Eerder zou dergelijke grote complexe moleculen hebben gekenmerkt gewoon zo lignine-achtige of tannine-achtige en veronderstelde te zijn geweest recalcitrant. De karakterisering van moleculaire-niveau, echter, kan de berekening van de NOSC van zelfs deze grote complexe moleculen. Deze NOSC-waarden zijn lineair gecorreleerd met de thermodynamische drijvende kracht, waardoor voor een beoordeling van de kwaliteit van organisch materiaal beschikbaar voor ontleding, die in veel gevallen blijkt dat deze complexe moleculen kan microbially afbreekbaar zelfs onder de zuurstofvrije omstandigheden die in waterrijke gebieden heersen.

Sinds invoering van O₂ organisch materiaal van bijna alle natuurlijk waargenomen NOSC waarden toelaat te worden ontleed, hierin richten we ons op veranderingen in de organische stof en microbiële proteomics die dreigen te worden van de primaire bestuurders in wetland (dat wil zeggen, beperkte O₂)-systemen. Alle technieken die we zullen bespreken, kunnen echter van een ecosysteem aan organisch materiaal te worden toegepast. Algemeen, bulk metingen gebaseerd op optische en fluorescentie analyses zijn gebruikt voor het beoordelen van de organische stof kwaliteit^3,14. Bij het gebruik van bulk metingen zoals deze, zijn fijne details echter verloren als grote aantallen van moleculen samen zijn gecategoriseerd onder generieke termen zoals humics of fulvics. De definities van deze categorieën zijn niet goed gebonden en, in feite, kunnen variëren van studie tot studie maken vergelijkingen niet onmogelijk. Verder, bulk metingen niet geven van de moleculair detail nodig voor de berekening van de thermodynamica van de regeling en daarom achterblijven echt beoordelen organische stof kwaliteit¹⁵.

Individuele technieken zoals Fourier transform ion cyclotron resonantie massaspectrometrie (FTICR-MS), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) en massaspectrometrie vloeistofchromatografie (LC-MS) doen bieden van dergelijke moleculair-niveau detail. Terwijl elk van deze technieken eigen beperkingen presenteert, brengen ze ook hun eigen sterke punten, die kunnen zijn leveraged in een geïntegreerde aanpak om de fijne moleculair detail nodig voor het kwantificeren van de kwaliteit van de organische stof in een rigoureuze thermodynamische zin . GC-MS is handig voor het identificeren van de kritische kleine metabolieten, die zouden kunnen proximale invloed hebben op CO₂ en CH₄ productie (bijvoorbeeld, glucose, acetaat, enz.); echter, GC-MS tegen een standaard verificatie vereist en is daardoor beperkt tot reeds bekende stoffen aanwezig in de database voorkomen identificatie van nieuwe verbindingen. GC-MS is bovendien een semi-kwalitatieve techniek waardoor gevolgtrekking over de wijzigingen in de relatieve concentraties, maar niet het verstrekken van feitelijke concentratie informatie die nodig is voor de berekening van de Gibb vrije energie bijvoorbeeld. Ten slotte, GC-MS vereist bewerking van moleculen vóór de analyse die resolutie verbindingen kleiner dan ~ 400 Da beperkt en vluchtige alcoholen verloren tijdens het drogen stap.

Eendimensionale (1D) ¹H vloeibare toestand NMR maakt zeer kwantitatieve karakterisering van kleine metabolieten (inclusief primaire kleine molecuulgewicht metabolieten en vluchtige stoffen als alcoholen, vinylacetaat, aceton, formate, pyruvaat, succinaat, korte-chained vetzuren, evenals een scala aan koolhydraten notoir afwezig of gecompromitteerde uit op basis van MS methoden) en de concentraties ervan zijn vooral nuttig voor de berekening van de thermodynamische parameters. Nog, net als GC-MS, 1D NMR van complexe mengsels normalisatie ten opzichte van een database vereist en daarom alleen kan geen gemakkelijke identificatie van nieuwe verbindingen die dreigen te worden overvloedig in complexe natuurlijke en veranderende ecosystemen. Bovendien, NMR is minder gevoelig dan de op basis van MS-technieken verwezenlijkt en derhalve, kwantitatieve metaboliet profilering is alleen boven 1 µM met behulp van NMR systemen uitgerust met helium gekoelde koude-sondes. Niet op grote schaal gewaardeerd, sommige NMR koude-sondes zijn zout-tolerante en milieu mengsel analyse in aanwezigheid van millimolar zout concentraties wanneer gebruikt in kleinere diameter (< 3 mm buitendiameter) monster-buizen¹⁶toestaan. Een verdere complicatie van de NMR is echter, dat grote hoeveelheden paramagnetisch metalen en mineralen (bv, Fe en Mn boven 1-3 wt %), die kan zijn overvloedig in hooggelegen bodems, kan verbreden spectrale kenmerken en compliceren interpretatie van de NMR-spectra . Met behulp van vaste fase extractie (SPE) kunt aide in de interpretatie van de NMR zowel metabolomica op basis van MS methoden door het verminderen van de minerale zouten en spectrale kwaliteit verhogen.

FTICR-MS door directe injectie is een uiterst gevoelige techniek voor het opsporen van tienduizenden van metabolieten van één sample van, maar het doet niet vangen de kritische kleine metabolieten zoals acetaat, pyruvaat en succinaat en is notoir moeilijk te gebruiken voor suikers en andere koolhydraten¹⁷, noch verstrekt het kwantitatieve informatie. Echter, in tegenstelling tot de andere technieken, FTICR-MS blinkt uit op te sporen en moleculaire formule toewijzen aan nieuwe verbindingen en daarom geeft het grootste aantal verbindingen meer moleculaire voorlichting dan een van de andere beschreven technieken. Dit is handig, omdat de moleculaire informatie verstrekt door FTICR-MS (en andere technieken) kan worden gebruikt voor het berekenen van NOSC dat verwant is aan de thermodynamische drijvende kracht inzake de waarschijnlijkheid van bepaalde reacties-⁸ en hun tarieven onder bepaalde voorwaarden⁷. Bovendien, door de koppeling van FTICR-MS met scheidingstechnieken, zoals LC samen met tandem MS, kwantitatieve structurele informatie kan worden bereikt, verrekening enkele nadelen van deze techniek. LC-MS is handig voor het identificeren van lipide-achtige verbindingen en andere metabolieten die niet goed gekarakteriseerd door een van de andere methoden. Koppeling LC FTICR-MS of LC-MS met een breuk verzamelaar en verzamelen van breuken van specifieke onbekenden van belang voor structurele opheldering van tweedimensionale (2D) vloeibare toestand die NMR de ideale situatie is voor het identificeren en kwantificeren van onbekende verbindingen^{18 ,19}. Dit is echter een zeer tijdrovende stap die kan worden gebruikt als en wanneer dat nodig is. Afzonderlijk genomen, elk van deze technieken bieden een verschillende momentopname van het organisch materiaal, en door hen te integreren, kunnen wij een vollediger inzicht dan het gebruik van een van de technieken in isolatie.

Terwijl de thermodynamische overwegingen stelt u de ultieme beperkingen op welke transformaties mogelijk in een systeem zijn, is decompositie van organisch materiaal bemiddeld door micro-organismen waarvan enzym activiteiten reactiesnelheden controleren. Dus volledig inzicht in de besturingselementen op de ontleding van organisch materiaal en uiteindelijk greenhouse gas (CO₂ en CH₄) productie van wetlands vraagt om een geïntegreerde omics benadering te karakteriseren van de microbiële enzym-activiteiten, alsmede de metabolieten. In dit artikel beschrijven we een methode voor het bereiken van dergelijke een uitgebreide analyse van een monster met behulp van een sequentiële aanpak die in een volledig gepaarde analyse resulteert. Deze aanpak wordt nader ingegaan op de metaboliet, eiwit en lipide-extractie (MPLex) protocol waarin proteomics ging gepaard met GC-MS en LC-MS²⁰ kleine metabolieten, eiwitten en lipiden identificeren door het opnemen van kwantitatieve metaboliet informatie via NMR en identificatie van grotere secundaire metabolieten via FTICR-MS. iets anders dan MPLex, we beginnen met het protocol met een water extractie en vervolgens gebruik sequentiële extractie met steeds meer niet-polaire oplosmiddelen. Alle extracties worden gedaan op een enkele monster dat monster bespaart wanneer volumes zijn beperkt of moeilijk te verkrijgen en vermindert van experimentele fout ingevoerd via variatie onder aliquots van heterogene monster matrices (b.v., bodem en turf) of verschillen in opslagomstandigheden en duur.

Tot slot, door de koppeling van de analyses OM met proteomics analyses van de microbiële Gemeenschap, kunnen we bouwen metabole netwerken die de trajecten en de transformatie van de ontleding van organisch materiaal beschrijven. Dit laat ons toe om specifieke hypothesen over hoe verstoringen op het systeem ultieme CO₂ en CH₄ productie door middel van wijziging van de beschikbare organische substraten, elektronen acceptoren en de microbiële gemeenschappen beïnvloeden zal testen bemiddelen de reacties via de activiteit van enzymen katalysatoren.

Het algemene doel van deze methode is bedoeld als een interne doorvoer-protocol voor het analyseren van de metabolieten, lipiden en microbiële eiwitten uit één sample waardoor een volledig gepaarde dataset voor het bouwen van metabole netwerken terwijl analytische fouten beperken .