כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו nanostructured הסיליקון הנקבובי (PSi) סרטים כמו ספקים מתכלה עבור גורם הגדילה העצבי (גורם הגדילה העצבי). בידול עצביים, תוצר של PC12 תאים ועכברים העזוב שורש גנגליון (DRG) נוירונים מאופיינים בעת טיפול עם נשאים PSi שנטענו גורם הגדילה העצבי.
למרות הפוטנציאל הגדול של גורם הגדילה העצבי לטיפול במחלות ניווניות, ניהול טיפולית שלה מייצג אתגר משמעותי כמו החלבון לא עובר את מחסום הדם – מוח, בשל תכונותיו כימי, ולכן דורש לטווח ארוך משלוח למוח יש השפעה ביולוגית. עבודה זו מתארת פבריקציה נוספת של nanostructured PSi סרטים כמו מתכלה נשאים של גורם הגדילה העצבי לאספקה מתמשכת של חלבון זה רגישים. נשאים PSi מותאמים במיוחד כדי להשיג יעילות גבוהה הטעינה שחרור רצוף של גורם הגדילה העצבי לתקופה של ארבעה שבועות, תוך שמירה על פעילותו הביולוגית. ההתנהגות של נשאים גורם הגדילה העצבי-PSi כמערכת משלוח גורם הגדילה העצבי הוא ובדוקים במבחנה על-ידי בדיקת היכולת שלהם ליצור בידול עצביים, תוצר של תאים PC12 הפומבית DRG נוירונים. תא הכדאיות בנוכחות נושאות PSi מסודר ונטענת על-ידי גורם הגדילה העצבי מוערך. Bioactivity של גורם הגדילה העצבי שוחררו נושאות PSi לעומת הטיפול המקובלת של הממשלים גורם הגדילה העצבי חינם חוזרות. PC12 תאית התמיינות מנותח, המאופיינת על ידי מדידת שלושה פרמטרים מורפולוגיות שונות תאים; (i) מספר neurites חילוץ מ- soma האורך של neurites הכולל (ii) ו- (iii) מספר נקודות הסתעפות. PC12 תאים שטופלו נושאות גורם הגדילה העצבי-PSi מדגימים הבחנה עמוקה לאורך כל תקופת השחרור. יתר על כן, תאים עצביים DRG תרבותי עם נשאים גורם הגדילה העצבי-PSi להראות חניכה נרחב neurite, הדומה נוירונים שטופלו חוזרות הממשלים גורם הגדילה העצבי חינם. נשאי tunable למד להפגין את השתלים לטווח ארוך לשחרור גורם הגדילה העצבי עם פוטנציאל מרפא מחלות ניווניות.
גורם הגדילה העצבי הוא חיוני בפיתוח ותחזוקה של נוירונים במערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית)1 , ממלאת תפקיד מכריע ההישרדות והתפקוד של נוירונים שימוש הקדמי הבזליים מערכת העצבים המרכזית (CNS)2. הפוטנציאל תרופתי גבוהה לטיפול במחלות ניווניות במרכז, כגון אלצהיימר, פרקינסון, נרחב הוכח, עם ניסויים קליניים כיום התקדמות3,4,5, 6. האתגר הגדול ביותר ב המשלוח של גורם הגדילה העצבי מערכת העצבים שוכן יכולתו לחצות את מחסום הדם מוח (BBB), כאשר ניתנת מערכתית7. יתר על כן, גורם הגדילה העצבי הרגישות להשפלה מהירה אנזימטי רינדור מחצית חיים קצר שלו ומגביל באופן משמעותי8,שלה לשימוש טיפולית9. לכן, אין אתגר קליניות לתכנן מערכות אספקה אשר מאפשרים שחרור ממושך ומבוקר של גורם הגדילה העצבי באופן בטוח. מערכות אספקה גורם הגדילה העצבי שונים, כולל מערכות מבוססות-פולימר, כבר למדתי10,11,12,13,14,15, 16 , 17. הפרופילים שחרור של מערכות אלה התאפיינו לעיתים קרובות פרץ הראשונית ברורים ולאחריו שחרור רציף איטי, איפה בשלב האחרון קצב השחרור היה נמוך באופן משמעותי בהשוואה פרץ הראשונית11 ,18,19. יתר על כן, איון של החלבון על ידי המוצרים השפלה חומצי פולימרים (למשל, חומצה poly(lactic-co-glycolic)) או אובדן של גורם הגדילה העצבי אתריים במהלך תהליך כימוס נצפו עם מערכות20.
Nanostructured PSi מאופיין על ידי מספר מאפיינים מושך, כולל את שטח גבוהה, נפח נקבוביות גדול, הביו tunable degradability בנוזלים שבגוף, predestining זה מבטיח סמים משלוח פלטפורמה21, 22,23,24,25,26,27,28. בחירה נכונה של תנאיה anodization מאפשר בקלות להתאים את PSi מאפיינים מבניים (למשל, נקבוביות, נקבוביות בגודל) תפירת סמים וטעינה של שחרור קינטיקה21,27. יתר על כן, מסלולים כימיים שונים נוחים מאפשרים לשנות את פני השטח של PSi ולא על ידי כך להמשיך לכוונן את קצב פירוק של לגרדום סי בתנאים פיזיולוגיים ושיעורי שחרור של סמים22,24, 29,30.
עבודה זו מתמקדת בעיצוב מערכת משלוח מבוססת-PSi לשחרור מבוקר ממושך של גורם הגדילה העצבי. השפעת גורם הגדילה העצבי-PSi נושאות על בידול עצביים, תוצר נבדק באמצעות תאים PC12, חלופה מועדפת DRG נוירונים. נדגים גורם הגדילה העצבי טעון שכרה אתריים שלה על ידי גרימת neurite תוצר ובידול עמוקה לאורך תקופה של חודש השחרור תוך ניהול יחידה.
Nanostructured מתכלה PSiO2 סרטים מפוברק, מועסקים ספקים עבור גורם הגדילה העצבי, המאפשר השקתו רציפה וממושכת, תוך שמירה על פעילותו הביולוגית. הפוטנציאל של PSiO2 לשרת כמו מערכת משלוח עבור גורם הגדילה העצבי הוא הפגין במבחנה על ידי הפגנת יכולתם לשחרר מינון גורם הגדילה העצבי זירוז בידול עצביים ולקדם המוצלח PC12 והתאים DRG נוירונים. הסרטים מהונדסים יכול לשמש כמאגר לטווח ארוך של גורם הגדילה העצבי עבור טיפול בעתיד בתוך vivo.
מאפיינים מבניים של הסרטים PSi מפוברק היו המותאמים במיוחד עבור גורם הגדילה העצבי המטען; צפיפות הזרם של תהליך אלקטרוכימי איכול הותאם להשיג גודל הנקבוביות של 40 ננומטר בקלות להכיל את גורם הגדילה העצבי, חלבון molecular weight של 26.5 kDa32 , קוטר האופיינית של ~ 4 nm33, בתוך המטריצה נקבובי. יתר על כן, חמצון תרמי של לגרדום נקבובי בוצע כדי לאפשר ספיחה פיסיקלית של גורם הגדילה העצבי על ידי משיכה אלקטרוסטטית של החלבון הטעון חיובית אל פני השטח PSi מחמצנים טעונים שלילית. הכימיה משטח של PSi מפעילה השפעה גדולה על היעילות הטעינה, ניתן לכוונן בקלות על מנת לשלוט טוב יותר את האינטראקציות בין המטען המטריקס נקבובי. אינטראקציות אלה לאחר מכן להכתיב את המבנה של מולקולות חלבון הספוחה ו שלהם35,34,bioactivity36. לסיכום, המערכת כוונן להשיג טעינה אופטימלית של גורם הגדילה העצבי על ידי בחירה מדוקדקת את הגודל המתאים נקבובית, המשטח האידיאלי טעינת הממס ואת השפעת וכתוצאה מכך כשואל הפרמטרים שהוזכרו ההעמסה חלבון יעילות. לכן, כל שינוי בפרמטרים פבריקציה נוספת (למשל, צפיפות זרם, תחריט זמן, סוג, ריכוז של dopant או אלקטרוליט), פלטות אלייזה או טעינת פתרון קומפוזיציה יכול להשפיע על יעילות ההעמסה ועל אתריים של חלבון טעון.
קצב שחרור תוכן מנה של מהמחשב המארח2PSi orPSiO בדרך כלל מוכתב על ידי שילוב של שני מנגנונים בו זמנית, out-דיפוזיה של מולקולות המטען והשפלות של לגרדום סי37. שחיקה של קצב התפרקות עוקבות מושפעים על ידי ההשרשה באתר, פתולוגיה שלה ועל המחלה המדינה28,38,39. היא הוקמה בשנת עבודה קודמות כי אם קצב שחרור שונים נדרש עבור יישום טיפולית מסוימת, פרופיל לשחרר אפשרות לשנותם ולאחר ממושך על ידי שינוי את הכימיה. משטח של PSi משטח38,40, 41. שינויים כימיים שונים, כגון חמצון תרמי, פחמון תרמי וטכניקות hydrosilylation, הוכחו לייצב את השטח PSi ומשפיעים שלה הסוגר ואת המטען שחרור35,42 ,43,44,45. יתר על כן, יביא הטעינה של גורם הגדילה העצבי לתוך נושאות על ידי קוולנטיות מצורף של מולקולות חלבון לגרדום סי בנתיבים שונים של פלטות אלייזה במהדורה ממושך יותר כי המנה הוא שוחרר רק כאשר. קשרים הדדיים שבורים או תמיכה סי מטריקס יורד21.
יתר על כן, בעקבות תהליך ייצור שלו, PSi שיכול להתבצע לתוך תצורות שונות מלבד סרטים רזה, כגון microparticles46, חלקיקים47 או ממברנות שעמד חופשי26, אשר יכול גם להיות מועסק נשאים עבור גורם הגדילה העצבי וצרכים לפגוש יישום מסוים.
כדי להיות הרלוונטית קלינית, התוכן גורם הגדילה העצבי של נשאים2 PSiO צריך להגיע לטווח של מינונים טיפולית. בהשיטה המתוארת בפרוטוקול, נושאות2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי יוכנסו נפח עקבית של 2 מ של תא מדיה או מאגר PBS, וכך הריכוז של הפתרון הטעינה, המסה גורם הגדילה העצבי בהתאמה טעון הותאמו להניב שוחרר ריכוז גורם הגדילה העצבי שהוא רלוונטי עבור מערכת שנבדקו במבחנה . כאשר בשיטה זו עבור מערכות שונות, כגון סביבות vivo לשעבר או ויוו , ריכוז גורם הגדילה העצבי טעינת פתרון צריך להיות גדל והוא מותאם על פי המינון הדרוש. לחלופין, ניתן לקבל תוכן גורם הגדילה העצבי גבוה יותר על ידי היכרות עם ספקים מרובים לכל אזור נבדק או באמצעות אזורים גדולים של PSiO2 דוגמאות.
יתר על כן, יש לציין כי מאוחר יותר נקודות זמן לאורך תקופת השחרור, ריכוז גורם הגדילה העצבי שפורסמו הם נמוכים בהרבה מאשר בנקודות זמן מוקדם יותר. העובדה כי שטף גורם הגדילה העצבי אינה קבועה לאורך זמן חייב להילקח בחשבון בעת תכנון המערכת בהתאם לצרכי יישום.
משלוח גורם הגדילה העצבי רבים פותחו ומערכות שדווחו בספרות, רובם נמצאים במערכות מבוססות-פולימר, הכוללת של פולימר סינטטי או טבעי conjugates10,11,12,15 , 16 , 17. מערכות אלו הראו יעילות מתמשכת שחרור פרופילים, עם זאת, תקופת השחרור מורחבים על פני תקופה של מספר ימים עם אפקט משמעותי פרץ. חלק פלטפורמות משלוח אלה סובלים מגבלות קריטיים כגון אובדן של bioactivity על התהליך כימוס, המחייב שימוש שונה ייצוב סוכנים18,48, כמו גם מתוחכם ומורכב טכניקות ייצור16. אחד האתגרים הגדולים ביותר בעיצוב מערכות אספקה חלבונים הוא היכולת לשמר את bioactivity של המולקולות על מילכוד בתוך מערכת המוביל. חלבונים או פפטידים ניתן לטעון לתוך PSi/PSiO2 -RT או אפילו בטמפרטורות נמוכות מבלי להשתמש חזקה ממיסים אורגניים, אשר הם שני גורמים חשובים בעת טעינת אלה מולקולות רגיש. מחקרים קודמים הראו כי PSi/PSiO2 פלטות אלייזה ממלאת תפקיד מכריע צמצום אפשרי דנטורציה של חלבונים טעון35,36. לכן, PSi/PSiO2 הוא nanomaterial יתרון פיתוח ותחזוקת מערכות אספקה עבור גורמי גדילה באופן כללי גורם הגדילה העצבי בפרט.
העבודה הנוכחית מתמקדת ניצול בשיטה זו כמו גישה טיפולית חדשה עבור ניהול ישיר של גורם הגדילה העצבי לתוך מערכת העצבים לטיפול פוטנציאלי של מחלות ניווניות. יכול להיות קטנטנים נושאות2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי במוח העכברים, היעילות של הפלטפורמה כמו שתלים לטווח ארוך למדה ויוו. יתר על כן, שילוב זה מבטיח נשאים עם biolistics לא פולשנית49,50 עשוי לאפשר אחד לנהל החלקיקים2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי ברזולוציה מרחבית מאוד את אזור מקומי באמצעות רומן פנאומטיים האקדח נימי לטיפול בהפרעות ניווניות, שבו נדרשת ייתכן והתרופות האמריקני. יתר על כן, גורם הגדילה העצבי יכולים לכוון את הצמיחה עצביים ב באופן הדרגתי כימי51, הדומה האקסון הדרכה מולקולות. לפיכך, נושאות2 PSiO טעון יכול לשמש attractant נקודות חמות כדי גורם הגדילה העצבי, להפנות את הצמיחה, משלים אחרים52,לבימוי רמזים53. בנוסף, נושאות2PSiO התפורות במיוחד כדי לקיים המסירה של גורם הגדילה העצבי לפרק מורחב הרבה זמן של עד מספר חודשים על ידי כוונון נוסף של ננו-מבנה2 PSiO וכימיה פני השטח שלו.
The authors have nothing to disclose.
MS ו- ES להכיר את שירותי ליבה ותמיכה מהמרכז משאית אני Lokey מדעי החיים, הנדסה, התמיכה הכלכלית של ראסל ברי לננוטכנולוגיה בטכניון.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |