Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en te fabriceren nanostructured poreuze silicium (PSi) films als afbreekbaar dragers voor de zenuw groeifactor (NGF). Neuronale differentiatie en uitgroei van PC12 cellen en muizen achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen worden gekenmerkt op een behandeling met de NGF-geladen PSi vervoerders.
Ondanks het grote potentieel van de NGF voor het behandelen van neurodegeneratieve ziekten, zijn therapeutische administratie vormt een aanzienlijke uitdaging als het eiwit niet van de bloed – hersen barrière overschrijden doet, als gevolg van de chemische eigenschappen, en vereist dus op lange termijn levering naar de hersenen om een biologisch effect te hebben. Dit werk beschrijft fabricage van nanostructured PSi films als afbreekbaar dragers van de NGF voor duurzame levering van deze gevoelige eiwit. De PSi-dragers zijn speciaal afgestemd op de hoge laden werkzaamheid en continu release van NGF verkrijgen voor een periode van vier weken met behoud van de biologische activiteit. Het gedrag van de NGF-PSi-dragers als een NGF uitvoeringssysteem is onderzocht in vitro door onderzoek van hun capaciteit voor het opwekken van neuronale differentiatie en uitgroei van PC12 cellen en gedissocieerde DRG neuronen. Levensvatbaarheid van de cellen in het bijzijn van netjes en NGF-geladen PSi vervoerders wordt geëvalueerd. De topicale van NGF vrijgegeven van de PSi-dragers wordt vergeleken met de conventionele behandeling van repetitieve gratis NGF overheidsdiensten. PC12 celdifferentiatie is geanalyseerd en wordt gekenmerkt door het meten van drie verschillende morfologische parameters van gedifferentieerde cellen; (i) het aantal neurites uitpakken vanaf het soma (ii) de totale neurites lengte en (iii) het aantal vertakkende punten. PC12 cellen behandeld met de NGF-PSi-vervoerders tonen een diepgaande differentiatie gedurende de release. Bovendien Toon DRG neuronale cellen gekweekt met de NGF-PSi-vervoerders een uitgebreide neurite initiatie, vergelijkbaar met neuronen behandeld met repetitieve gratis NGF overheidsdiensten. De bestudeerde afstembare dragers demonstreren de langdurige implantaten voor NGF release met een therapeutisch potentieel voor neurodegeneratieve ziekten.
NGF is essentieel voor de ontwikkeling en het onderhoud van neuronen in het perifere zenuwstelsel (PNS)1 en speelt een cruciale rol in het behoud en de functie van basale reukkolf cholinerge neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)2. Hoge farmacologisch benut voor de behandeling van centrale neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer en Parkinson, wijd gebleken, met klinische proeven momenteel in vooruitgang3,4,5, 6. De grootste uitdaging in de levering van de NGF aan de CNS woont in haar onvermogen om over te steken van de bloed-hersenbarrière (BBB), systemisch toegediend7. Bovendien NGF gevoeligheid voor snelle enzymatische afbraak maakt haar korte halfwaardetijd en aanzienlijk beperkt zijn therapeutisch gebruik8,9. Daarom is er een onvervulde uitdaging voor het ontwerp van afgiftesystemen waarmee op een veilige manier voor een langdurige en gecontroleerde vrijlating van de NGF. Verschillende NGF levering systemen, met inbegrip van polymeer gebaseerde systemen geweest bestudeerde10,11,12,13,14,15, 16 , 17. de profielen van de release van deze systemen werden vaak gekenmerkt door een duidelijke eerste uitbarsting, gevolgd door een continue langzaamwerkend, waar in de laatste fase het introductie tarief was aanzienlijk laag in vergelijking met de eerste uitbarsting11 ,18,19. Bovendien inactivering van het eiwit door de zure afbraakproducten van de polymeren (bijvoorbeeld, poly(lactic-co-glycolic) zuur) of verlies van de NGF topicale tijdens de inkapseling werden waargenomen met deze systemen20.
Nanostructured PSi wordt gekenmerkt door een aantal aantrekkelijke eigenschappen, met inbegrip van haar hoge oppervlakte, grote poreuze volume, biocompatibiliteit en afstembare afbreekbaarheid in lichaamsvloeistoffen, het predestining voor een veelbelovende drug delivery platform21, 22,23,24,25,26,27,28. Juiste keuze anodisatie voorwaarden kunt gemakkelijk aanpassen van de PSi structurele eigenschappen (b.v., porositeit en porie-grootte) voor het afstemmen van de drug laden en release kinetiek21,27. Bovendien laat verschillende handige chemische routes het oppervlak van de PSi te wijzigen en door die verder afstemmen de oplossnelheid van de Si-steiger onder fysiologische omstandigheden en de tarieven van de release van de drug22,24, 29,30.
Dit werk richt zich op het ontwerpen van een PSi gebaseerde expresbezorgingssysteem voor langdurige gecontroleerde afgifte van de NGF. Het effect van de NGF-PSi-dragers in neuronale differentiatie en uitgroei is onderzocht met behulp van PC12 cellen en losgekoppeld van de DRG neuronen. We laten zien dat de geladen NGF haar topicale heeft bewaard door inducerende neurite uitgroei en diepgaande differentiatie gedurende een periode van 1 maand release binnen een eenmalige toediening.
Afbreekbaar nanostructured PSiO2 films zijn vervaardigd en werkzaam als dragers voor NGF, waardoor voor de continue en langdurige release, met behoud van de biologische activiteit. Het potentieel van de PSiO2 om te dienen als een expresbezorgingssysteem voor NGF is aangetoond in vitro door aan te tonen hun vermogen om voldoende NGF dosering voor induceren van neuronale differentiatie en het bevorderen van de uitgroei van PC12 cellen en neuronen van de DRG vrij te geven. De gemanipuleerde films kunnen worden gebruikt als op lange termijn reservoirs van NGF voor toekomstige behandeling in vivo.
De structurele eigenschappen van de gefabriceerde PSi films werden op maat gemaakt speciaal voor NGF lading; de stroomdichtheid van het elektrochemisch etsen-proces werd aangepast om op te halen van de poriegrootte van ongeveer 40 nm dat zou gemakkelijk de NGF, een eiwit met een molecular weight van 26,5 kDa32 en een karakteristiek diameter van ~ 4 nm33, binnen de poreuze matrix. Bovendien, thermische oxidatie van de poreuze steiger werd uitgevoerd zodat de fysische adsorptie van NGF door elektrostatische aantrekking van de positief geladen eiwitten aan de negatief geladen geoxideerd oppervlak van de PSi. De Oppervlaktechemie van PSi oefent een grote invloed op de werkzaamheid van het laden en gemakkelijk kan worden afgestemd om betere controle van de interacties tussen de lading en de poreuze matrix. Deze interacties bepalen vervolgens de structuur van de geadsorbeerde eiwitmolecules en hun topicale34,35,,36. Kortom, werd het systeem aangepast om optimaal laden van NGF verkrijgen door zorgvuldig te selecteren van de juiste poriegrootte, oppervlakte kenmerken en de ideale laden oplosmiddel en het resulterende effect van het dictaat van de genoemde parameters het eiwit laden werkzaamheid. Daarom wijzigingen in de parameters van de fabricage (b.v., stroomdichtheid, ETS tijd, aard en concentratie van dopering of elektrolyt), oppervlakte chemie of laden oplossing samenstelling kan invloed hebben op de werkzaamheid van de laden en topicale van de geladen eiwitten.
Het tarief van de introductie van een lading van de PSi-orPSiO2-host wordt over het algemeen bepaald door een combinatie van twee gelijktijdige mechanismen, proefliggen diffusie van de nettolading moleculen en de aantasting van de Si steiger37. De erosie en de daaropvolgende oplossnelheid worden beïnvloed door de innesteling site, de pathologie en ziekte staat28,38,39. Het werd opgericht in vorige werk dat als een verschillende versie tarief vereist voor een bepaalde therapeutische toepassing is, het release-profiel kan worden gewijzigd en verlengd door het veranderen van de Oppervlaktechemie van de PSi oppervlakte38,40, 41. Verschillende chemische wijzigingen, zoals thermische oxidatie, thermische verkoling en hydrosilylation technieken, is aangetoond dat het oppervlak van de PSi te stabiliseren en invloed hebben op de afbraak en de daarop volgende lading release35,42 ,43,44,45. Bovendien, laden van NGF in de dragers door covalente gehechtheid van de eiwitmolecules aan de steiger van de Si via verschillende Oppervlaktechemie routes moet leiden tot een langduriger release omdat de nettolading slechts vrijgegeven wordt wanneer de covalente bindingen verbroken worden of de ondersteuning van Si matrix is gedegradeerd21.
Bovendien, naar aanleiding van haar productie-procédé, PSi kan worden gerenderd in verschillende configuraties naast dunne lagen, zoals microdeeltjes46, nanodeeltjes47 of vrijstaande membranen26, die ook kan worden gebruikt als dragers voor de NGF en behoeften voldoen aan specifieke toepassing.
Om klinisch relevante, moet de inhoud van de NGF binnen de PSiO-2 -dragers het scala aan therapeutische doses bereiken. Van de methode beschreven in het protocol, de NGF-geladen PSiO2 dragers worden ingevoerd in een consistent volume van 2 mL van cel media of PBS buffer en dus de concentratie van de oplossing van de laden en de respectieve NGF massa geladen werden aangepast zodanig dat deze een NGF-concentratie die relevant is voor het systeem getest in vitro uitgebracht. Bij gebruik van deze methode voor verschillende systemen, zoals omgevingen ex vivo of in vivo , moet de concentratie van de NGF laden oplossing worden verhoogd en aangepast volgens de benodigde dosis. Hoger gehalte van de NGF kan ook worden verkregen door de invoering van meerdere vervoerders per geteste gebied of met behulp van grotere gebieden van PSiO2 monsters.
Bovendien moet opgemerkt worden dat in latere tijd punten langs de release periode, de vrijgegeven NGF-concentraties veel lager dan in eerdere tijd punten zijn. Bij het ontwerpen van het systeem volgens de behoeften van de toepassing, moet rekening worden gehouden met het feit dat de NGF-flux niet constant in de tijd is.
Talrijke NGF levering systemen zijn ontwikkeld en gemeld in de literatuur, de meeste van hen zijn polymeer gebaseerde systemen, bestaande uit natuurlijke of synthetische polymeren conjugaten10,11,12,15 , 16 , 17. deze systemen is effectief gebleken aanhoudende release profielen, echter de release periode spanned over een periode van enkele dagen met een aanzienlijke burst-effect. Sommige van deze platforms levering lijden aan kritische beperkingen zoals verlies van topicale op het proces van inkapselen, waarvoor gebruik van verschillende stabiliserende agenten18,48, evenals geavanceerde en complexe fabrication technieken16. Een van de grootste uitdagingen bij het ontwerpen van toedieningssystemen voor eiwitten is de mogelijkheid om de topicale van de moleculen op entrapment binnen de carrier systeem behouden. In PSi/PSiO2 op RT of zelfs bij lagere temperaturen kunnen eiwitten of peptides worden geladen zonder gebruik te maken van sterke organische oplosmiddelen, die beide belangrijke factoren bij het laden van deze gevoelige biomoleculen. Eerdere studies hebben aangetoond dat PSi/PSiO2 Oppervlaktechemie een cruciale rol speelt bij het minimaliseren van mogelijke denaturatie van de geladen eiwitten35,36. Daarom is PSi/PSiO2 een voordelige nanomateriaal voor de ontwikkeling van toedieningssystemen voor factoren die de groei in het algemeen en NGF in het bijzonder.
Het huidige werk is gericht op gebruik te maken van deze methode als een nieuwe therapeutische benadering voor het directe beheer van NGF in de CNS voor mogelijke behandeling van neurodegeneratieve ziekten. De NGF-geladen PSiO2 vervoerders kunnen worden geïmplanteerd in de hersenen van muizen en de werkzaamheid van het platform als op lange termijn implantaten is studeerde in vivo. Bovendien, het combineren van deze veelbelovende vervoerders met niet-invasieve biolistics49,50 kunnen één voor het beheer van de NGF-geladen PSiO2 deeltjes in een zeer ruimtelijke resolutie naar een gelokaliseerde gebied met behulp van een pneumatische roman capillaire pistool voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen, waar een Spatio drug administration is vereist. Bovendien kan NGF neuronale groei direct in een chemische kleurovergang wijze51, vergelijkbaar met axon begeleiding moleculen. Dus, de geladen PSiO2 dragers kunnen dienen als lokstof hotspots aan NGF, om groei, complementair aan andere leiding signalen52,53. Bovendien, kunnen de PSiO2vervoerders worden specifiek aangepast ondersteunen de levering van de NGF gedurende een tijd veel-uitgebreid tot enkele maanden door verdere tuning de nanostructuur van de2 PSiO en haar oppervlakte chemie.
The authors have nothing to disclose.
MS en ES erkennen de kernservices en steun van het Lorry I. Lokey centrum voor leven wetenschap en techniek en de financiële steun van de Russell Berrie nanotechnologie Instituut van het Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |