आंतों भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग और अपने लाइव चूहों में मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन की प्रेरण
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि allogeneic टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण का वर्णन करता है और उपस्थिति, विशेषताओं, और जीने के भीतर बृहदांत्र सूजन की गंभीरता के लिए बाहर बृहदांत्र के दोहराव मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन की अनुमति देता है वर्तमान चूहों आंत्र भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग से पीड़ित ।
Abstract
तीव्र भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग (GvHD) सबसे गंभीर जटिलता का प्रतिनिधित्व करता है कि रोगियों को पहले allogeneic टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (एलो-HCT) चेहरे के दौर से गुजर रहा है और अक्सर एक गरीब नैदानिक परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है । जबकि, उदाहरण के लिए, त्वचा की GvHD अभिव्यक्तियां आमतौर पर स्थापित प्रतिरक्षा-शमन चिकित्सा के लिए उत्तरदाई है और कर रहे हैं, इसलिए, एक घातक पाठ्यक्रम नहीं ले, उपस्थिति और आंतों GvHD की तीव्रता, विशेष रूप से मध्य के लिए पेट के निचले भागों, दृढ़ता से परिणाम और तीव्र GvHD के साथ रोगियों के समग्र अस्तित्व को प्रभावित । चिकित्सकीय विकल्प अनिवार्य रूप से केवल मध्यम रोग-प्रभाव को कम उपज क्लासिक प्रतिरक्षा शमन एजेंटों के लिए सीमित कर रहे हैं । इसलिए, ऊतक के बारे में विस्तृत ज्ञान निवासी प्रतिरक्षा झरना, आंतों microbiota में परिवर्तन, और stromal प्रतिक्रिया से पहले, पर, और आंतों GvHD शुरुआत के बाद तत्काल घटनाओं और अपने अंतर्निहित तंत्र को समझने की जरूरत है रोगजनन और अभिनव चिकित्सीय विकल्प विकसित करने के लिए । GvHD के Murine मॉडल अक्सर की पहचान करने और कार्यात्मक अणुओं और रास्ते आंत्र GvHD ड्राइविंग putatively का आकलन करने के लिए कार्यरत हैं । हालांकि, विशेष रूप से निगरानी और समय के साथ आंतों की सूजन का मूल्यांकन करने का मतलब है अनिवार्य रूप से कमी के बाद से स्थापित स्कोर का आकलन करने के लिए और तीव्र GvHD ग्रेड नियमित रूप से विभिंन मापदंडों जो बल्कि प्रणालीगत GvHD प्रतिबिंबित के शामिल है अभिव्यक्तियों. आंत्र GvHD के विस्तृत मूल्यांकन euthanized चूहों का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है, जिससे अनिवार्य रूप से अनुदैर्ध्य को छोड़कर (यानी, काइनेटिक) एक दी प्रयोगात्मक स्थिति के तहत कालोनी डिब्बे का विश्लेषण (जैसे, एंटीबॉडी-मध्यस्थता लाइव चूहों में एक भड़काऊ cytokine की नाकाबंदी) (यानी, vivo में). HCT-इलाज चूहों के बाहर बृहदांत्र के सीटू आकलन में मिनी-इंडोस्कोपिक यहां वर्णित एक) आंतों की सूजन और ख के विभिन्न पहलुओं का एक विस्तृत macroscopic मूल्यांकन) के लिए बहाव के विश्लेषण के लिए ऊतक के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए विकल्प की अनुमति देता है अवलोकन अवधि के दौरान विभिन्न समय अंक । कुल मिलाकर, मिनी इंडोस्कोपिक दृष्टिकोण नैदानिक इनवेसिव निगरानी और आंत्र GvHD के आकलन में एक प्रमुख अग्रिम प्रदान करता है ।
Introduction
टेम द्रोह सीधे टेम स्टेम सेल कम्पार्टमेंट और अनियंत्रित, तेजी से प्रगति, और गंभीर प्रतिरक्षा मध्यस्थता विकारों से उत्पन्न होने वाले अक्सर एलो-HCT1,2प्रदर्शन करने के लिए संकेत कर रहे हैं. हालांकि, हालांकि शकुन लाभकारी भ्रष्टाचार की घटना बनाम ट्यूमर प्रतिक्रिया के लिए लेखांकन, दाता लिम्फोसाइटों अक्सर उत्प्रेरण और एलो-HCT प्राप्तकर्ता के भीतर स्वस्थ ऊतक घटकों के एक अवांछित प्रतिरक्षा मध्यस्थता हमले को बढ़ावा देने रहे हैं , एक प्रक्रिया है कि भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग3कहा जाता है । पेट में अभिव्यक्ति, तथाकथित आंत्र GvHD, तीव्र GvHD की सबसे खतरनाक जटिलता का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिनमें से गंभीर रूपों नियमित रूप से एक उच्च मृत्यु दर1,2,4के साथ जुड़े रहे हैं ।
कुल मिलाकर, एलो-HCT के murine मॉडल5GvHD की रोगजनन अंतर्निहित प्रतिरक्षा-मध्यस्थता तंत्र की पहचान और अध्ययन करने के लिए अमूल्य औजार के रूप में उभरे हैं. हालांकि, के काइनेटिक मूल्यांकन, उदाहरण के लिए, जीवित चूहों में समय पर उपंयास चिकित्सीय हस्तक्षेप के लाभकारी प्रभाव नियमित रूप से नैदानिक GvHD स्कोर6के निर्धारण पर आधारित है । हालांकि इन स्कोरों को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयुक्त हैं, उदाहरण के लिए, समग्र रोग बोझ (यानी, प्रणालीगत GvHD), नैदानिक स्कोर मज़बूती से शरीर के अंग-विशिष्ट अभिव्यक्तियों (जैसे, पेट में) के लिए संवेदनशीलता की कमी है । इसलिए, निष्कर्ष, उदाहरण के लिए आंत के संबंध में एक चिकित्सीय हस्तक्षेप के सुरक्षात्मक प्रभाव के साथ, कि इन स्कोरिंग सिस्टम पर आधारित है आमतौर पर कम गिर जाते हैं ।
उपंयास पूरे शरीर इमेजिंग के आविष्कार के माध्यम से प्रमुख अग्रिम के बावजूद या तो bioluminescent या फ्लोरोसेंट आनुवंशिक माउस मॉडल7,8, के उपयोग के साथ संयोजन में तरीकों को सीधे और विशेष रूप से जीना चूहों में GvHD की आंतों की अभिव्यक्ति का आकलन कमी कर रहे हैं. इसलिए, अगले खंड में वर्णित आंतों GvHD phenotype के इंडोस्कोपिक आकलन के प्रोटोकॉल के पीछे तर्क इस बाधा को दूर करने के लिए है । इसके अलावा, प्रेरणा भी प्रयोगात्मक चूहों संख्या को कम करने के बाद से है, अब तक, सेलुलर, रूपात्मक, और आणविक विशेषताओं का एक विस्तृत आकलन (जैसे, histopathology या आणविक जीवविज्ञान) आंतों GvHD के द्वारा अभिव्यक्ति अंततः प्रयोगात्मक माउस के बलिदान की आवश्यकता है ।
हमारे संस्थान पहले syngeneic कोलाइटिस मॉडल9के पाठ्यक्रम में बृहदांत्र अभिव्यक्तियों के एक मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन की कार्यप्रणाली पर सूचित किया है । प्रोटोकॉल में यहां प्रस्तुत है, हम और परिष्कृत है colonoscopic स्कोरिंग मैट्रिक्स alloresponse के लिए प्रेरित-alloreactive HCT और दाता लिम्फोसाइटों के एक MHC वर्ग में प्रत्यारोपण पर आंतों GvHD के साथ जीना चूहों में कोलाइटिस चालित मैं पूरी तरह से बेमेल सेटिंग . हम आंतों GvHD-संबंधित बृहदांत्र घावों को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयुक्त चार मापदंडों की पहचान की । इसके अलावा, हम एक प्रणाली है कि किसी भी एक निर्धारक के ग्रेडिंग एक ठीक देखते की अनुमति देता है की स्थापना की, एक नया स्कोर है कि आसानी से आंतों GvHD की गंभीरता के बारे में एक निश्चित समय बिंदु पर दिए गए माउस में मौजूद पाठक बताते में जिसके परिणामस्वरूप । Histopathological विश्लेषण की पुष्टि की है कि एक निश्चित सीमा के ऊपर एक इंडोस्कोपिक स्कोर मज़बूती से मध्यम से उच्च ग्रेड ऊतक सूजन की भविष्यवाणी है । इसलिए, मिनी इंडोस्कोपिक मूल्यांकन सोने के मानक histopathology कि नियमित रूप से प्रयोगात्मक चूहों के बलिदान की आवश्यकता के लिए एक काम के विकल्प का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रकट होता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल वस्तुतः किसी भी समय बिंदु पर लागू किया जा सकता है और बार में रोग के दौरान किया जा सकता है10,11। इसके अलावा, bioluminescence के उपयोग पर निर्भर दृष्टिकोण के विपरीत, कोई श्रम-तीव्र और समय लेने आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों परस्पर की तरह उपाय और आवश्यक हैं, इसलिए, पद्धति वस्तुतः किसी भी माउस लाइन पर लागू किया जा सकता है ब्याज.
एक साथ लिया, HCT के हानिकारक नैदानिक परिप्रेक्ष्य गंभीर आंत्र GvHD, तेजी से वैज्ञानिक प्रगति और आणविक प्रतिरक्षा रोगजनन अंतर्निहित तंत्र में अधिक जानकारी के साथ रोगियों की तत्काल जरूरत है दिया । इसी तरह, महत्वपूर्ण, नैतिक विचारों की मांग है कि ज्ञान का लाभ प्रयोगात्मक चूहों की न्यूनतम संख्या के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए । इसलिए, दोनों को मांयता प्राप्त अनुसंधान आंत्र GvHD खोज समुदाय पर दावा धारावाहिक मिनी प्रयोगात्मक कार्य श्रृंखला में बृहदांत्र के इंडोस्कोपिक मूल्यांकन को लागू करने के द्वारा उंनत किया जा सकता है और निगरानी के लिए जी प्रयोगात्मक माउस में आंत्र GvHD ग्रेड मॉडल, के रूप में वर्णित है और यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में मांय ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल की कार्यप्रणाली का वर्णन करता है प्रेरण और मिनी-इंडोस्कोपिक मूल्यांकन के बृहदांत्र phenotype के पाठ्यक्रम में मनाया आंतों GvHD । यह वैज्ञानिकों आंतों GvHD longitudinally अध्ययन करने के लिए सक्षम करने के व्याप?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन सहयोगी अनुसंधान केन्द्रों (सीआरसी) २२१ (सीआरसी/TR221-DFG, #324392634; परियोजना B03) (K.H. को) और सीआरसी ११८१ (सीआरसी-DFG, परियोजना B05) (K.H.), दोनों ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
Riferimenti
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