Summary

متعدد الفلورسنت المناعي تلطيخ والتصوير والتحليل في عينات نسيجية من سرطان الغدد الليمفاوية

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول متعدد المناعي الفلورسنت تلطيخ والتصوير للترجمة المتزامنة متعددة المستضدات المرتبطة بالسرطان في الأورام اللمفاوية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل المؤشرات الحيوية داخل جميع أقسام الأنسجة كولوكاليزيشن.

Abstract

أساليب المناعي (المدينة) لتحليل التعبير البروتين بالفحص المجهري الخفيفة في الموقع أداة قوية للبحث وأغراض التشخيص. ومع ذلك، التصور والتقدير الكمي لمولدات المضادات المتعددة في مقطع واحد من أنسجة استخدام المدينة اللونية التقليدية يمثل تحديا. التصوير متعدد مهم خصوصا في أبحاث سرطان الغدد الليمفاوية، والتشخيص، حيث علامات يجب أن تفسر في سياق معقدة وورم المكروية. هنا يصف لنا وضع بروتوكول للمدينة الفلورسنت متعدد تلطيخ لتمكين التقييم الكمي لأهداف متعددة في خلية معينة أنواع المصالح في الأورام اللمفاوية. الأسلوب الذي يغطي جوانب من التحقق من صحة جسم، والأجسام المضادة الأمثل، الأمثل متعدد مع علامات لمفوما الأنواع الفرعية، تلطيخ الأنسجة الشرائح ميكرواري (تي أم أية)، ومسح الشرائح، متبوعاً بتحليل البيانات، مع محدد إشارة إلى سرطان الغدد الليمفاوية. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إنشاء عشرات لكل شدة يعني علامة على الاهتمام والإيجابية النسبة المئوية تيسير المزيد من التحليل الكمي. الإرسال المتعدد يقلل استخدام العينة، ويوفر المعلومات المكانية لكل علامة للفائدة.

Introduction

الأورام اللمفاوية بسبب انتشار الخلايا الليمفاوية الخبيثة غير المنضبط. هذه الخلايا هي عناصر حيوية في الجهاز المناعي، وتعريب لأجهزة المناعة الأولية والثانوية، مثل نخاع العظام والعقد الليمفاوية والطحال ونظام اللمفاوية الأخرى المرتبطة بالغشاء المخاطي. الأورام اللمفاوية هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات التي تصنف استناداً إلى كوكبة من الميزات، بما في ذلك مورفولوجيا، إيمونوفينوتيبي، والسمات الوراثية، والعرض التقديمي السريرية. بينما يلعب كل معلمة جزء، النسب ما زالت سمة المميزة ويشكل الأساس لنظام تصنيف منظمة الصحة العالمية التي تعترف بالأورام المستمدة من الخلايا ب وخلايا T القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) الخلايا1.

وكان مفتاح للتصنيف للأورام اللمفاوية توصيف الأجسام المضادة ضد علامات سطح الكريات البيض من الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليمفاوية2. إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) قد استخدم تقليديا لتحليل مثل هذه العلامات، ويستند إلى مبدأ الاعتراف ضد مستضد محدد للكشف عن الجزيئات المستندة إلى الخلايا والأنسجة التي يمكن تصور من خلال المجهر الخفيفة 3. بيد أن تحديد أهداف متعددة على شريحة واحدة من التقليدية مشرق حقل المدينة متعدد اللونية بقيود لأنه غالباً ما يصعب التمييز بين إشارات متعددة الألوان على مقطع نسيج واحد موثوق بها، لا سيما لمولدات المضادات مع تعبير منخفضة جداً4. التقييم البصري والتحديد الكمي لتلطيخ أيضا يمكن أن تكون ذاتية، تسبب تقلب في تفسير البيانات وتحليل5.

ولذلك، المدينة التقليدية على عينات (FFPE) الفورمالين–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين ليس عمليا للكشف عن واحد من أهداف متعددة في أمراض متنوعة مناعي مثل الأورام اللمفاوية. وعلاوة على ذلك، التمييز بين الخلايا الليمفاوية الورمية من الخلايا المناعية المحيطة غالباً غير دقيقة. وهذا يعوق دراسات تبحث في أهمية المؤشرات الحيوية الرواية في الأورام اللمفاوية. وفي هذا السياق، يقدم المدينة الفلورسنت متعدد (وسط-المدينة) بديلاً واعداً كما أنها تتيح التقييم الكمي مستضد كوكسبريشن وعلاقة مكانية بدقة أعلى مع المحافظة على محدودية العينات6،7- عندما هذا تكنولوجيا التصوير هو في شراكة مع برنامج تحليل الصور الرقمية، تفسير البيانات أكثر كفاءة ويسهل دراسة الأورام والمكرويه التغايرية8،9. في هذا البروتوكول، أساس تيراميدي الفلورة (إذا كان) الإرسال المتعدد الأسلوب يتم تطبيقه على تضخيم الإشارات وهو متوافق مع أي جسم التحقق من صحة المدينة من أي الأنواع المضيفة، حتى تلك التي وضعت في نفس الأنواع5،7 , 10-يسمح البروتوكول على أساس تيراميدي لتصريف fluorophore لانسجة الاهتمام المباشر بحيث يمكن تجريده جسم الابتدائي والثانوي بعد كل خطوة، يسمح بتطبيق متسلسلة من البقع متعددة دون جسم ه.

استراتيجية متعدد ستكون مفيدة للتنبؤ بنتائج التشخيص والعلاج عن طريق تحديد الأهداف وأنماطها المناعية البديل في الأورام الليمفاوية. متعدد الفلورسنت المدينة قد طبقت في لدينا مختبر لدراسة فريق من علامات مساعد تي الحبيبي في أنجيويمونوبلاستيك تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية (أيتل)، وعلامات تي وب اللمفاويات نوع فرعي الأورام اللمفاوية تي خلية الطرفية تتسم بالعدوانية السريرية السلوك والورم التغايرية11. ويتضح مدى فائدة هذا الأسلوب أيضا اللمفاوية ب-الخلايا الكبيرة منتشر (DLBCL)، مما يشير إلى زيادة في مستقبل خلايا ب مع التعبير المتزامن ج-حركة و BCL-2 تقترح فيها استخدام العلاجية المحتملة تيروزين كيناز تثبيط لبروتون 12 .

هنا يمكننا وصف بروتوكول كامل من التحقق من صحة جسم اختيار عنصر التحكم المناسب الأنسجة ومضاعفة استخدام لمفوما FFPE الآلي الأنسجة، مع تحليل في نهاية المطاف للشرائح ملطخة باستخدام المسح التصوير الكمي في علم الأمراض النظام.

Protocol

وتم الحصول على جميع الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول قيد “سنغافورة NHG المجال محددة استعراض المجلس ب” دراسة 2014/00693. 1-التحديد والتحقق من صحة من الأجسام المضادة ملاحظة: قبل الشروع في إنشاء أي فريق متعدد، تأكد من أن جميع الأجسام المضادة وصمة قوة، تحديد فقط مستضد …

Representative Results

صور وسط المدينة عينة DLBCL مع ج-حركة وإعادة ترتيب الجينات BCL2 (مزدوج–ضرب سرطان الغدد الليمفاوية) يرد في الشكل 1. ويبين الشكل 2 الصور محاكاة مشرق الميدان المناعي. يشير الرقم 3 إلى توليد بيانات النسبة المئوية. يعرض الرق…

Discussion

وسط المدينة لديه القدرة على تمكين أخصائيي علم الأمراض لصقل دياجنوستيككريتيريا في علم الأمراض اللمفاوية وتحليل دور المؤشرات الحيوية في أنواع الخلايا المحددة تجاه تنبؤ بالنتائج السريرية. كأسلوب جديد في بحث، يتم تطبيق وسط المدينة متزايدة إلى تحديد الكمية والمكانية لمعلمات متعددة محصنة من…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

س-ب. ن. و A.D.J. معتمدة من قبل وزارة الصحة في “سنغافورة الوطنية الطبية المجلس الانتقال الجوائز البحثية” (نمرك/تا/0020/2013 ونمرك/تا/0052/2016). يعترف الكتاب “منحة بحثية يون سيو يونغ” إلى A.D.J. من “جامعة سرطان معهد سنغافورة الوطنية” نحو شراء مجهر التصوير الطيفي فكترا. وافقت هذه الدراسة “سنغافورة NHG المجال محددة استعراض المجلس ب” (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

Riferimenti

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
  4. Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).

Play Video

Citazione di questo articolo
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

View Video