该协议描述了为基于液滴、高通量的单细胞 rna-seq 制剂准备健康的成年哺乳动物单细胞所需的一般过程和质量控制检查。还提供了测序参数、读取对齐和下游单细胞生物信息学分析。
分析组织或微环境中数千个单个细胞的单个细胞基因表达是识别细胞组成、功能状态的判别以及观察到的组织背后的分子途径的宝贵工具功能和动物行为。然而, 分离完整的, 健康的单个细胞从成年哺乳动物组织, 以便随后下游单细胞分子分析可能是具有挑战性的。该协议描述了从神经系统或皮肤获得高质量成人单细胞制剂所需的一般过程和质量控制检查, 从而能够进行后续的无偏见单细胞 rna 测序和分析。还提供了下游生物信息学分析的指南。
随着高通量单细胞技术 1、2 的发展和用户友好生物信息学工具在过去十年3的进步, 高分辨率基因表达分析的一个新领域已经出现–单细胞 rna 测序 (scrna-seq)。对单个细胞基因表达的研究最初是为了识别定义的细胞群 (如干细胞或癌细胞) 中的异质性, 或者是为了识别 4、5 细胞中罕见的细胞群, 这些细胞是无法使用传统的块状 rna 测序技术。生物信息工具使人们能够识别新的亚群 (seurat)2, 可视化沿 psuedotime 空间 (monocle)6的细胞顺序, 定义种群内或种群之间的主动信号网络 (场景)7, 预测在人工3d 空间 (seurat 等) 中组装单个细胞的情况.随着这些新的和令人兴奋的分析提供给科学界, scrna-seq 正在迅速成为基因表达分析的新标准方法。
尽管 scrna-seq 具有巨大的潜力, 但生成干净的数据集和准确解释结果所需的技术技能对新来者来说可能具有挑战性。这里提出了一个基本但全面的协议, 从从从整个主要组织分离单个细胞到可视化和表示用于发布的数据 (图 1)。首先, 健康的单个细胞的分离可以被认为是具有挑战性的, 因为不同的组织对酶消化和随后的机械离解的敏感性程度各不相同。此协议在这些隔离步骤中提供指导, 并在整个过程中确定重要的质量控制检查点。其次, 了解单个单元技术和下一代测序技术之间的兼容性和要求可能会造成混淆。该协议提供了实现用户友好的、基于液滴的单细胞条形码平台和执行测序的指南。最后, 计算机编程是分析单细胞转录数据集的重要前提。此协议提供了开始使用 r 编程语言的资源, 并提供了有关实现两个流行的 srna-seq 特定 r 包的指导。该协议可以共同指导新来者执行 scrna-seq 分析, 以获得清晰、可解释的结果。该协议可以根据小鼠的大多数组织进行调整, 重要的是可以修改为与包括人体组织在内的其他生物一起使用。根据组织和使用者的不同进行调整。
在遵循此协议时, 需要记住几个注意事项;包括, 1) 建议遵循本协议第1步和第2步中的所有质量控制准则, 以确保感兴趣样本中所有细胞的单细胞悬浮, 同时确保准确的细胞总数计数 (图2概述) ).一旦实现了这一点, 如果遵循了所有优化的条件, 质量控制步骤就可以放弃 (以节省时间–保持 rna 质量和减少细胞丢失)。在任何下游处理之前, 强烈建议您确认成功地从感兴趣的组织中分离出高活性的单细胞。2) 由于某些细胞类型对压力比其他细胞更敏感, 过度分离技术会无意中偏向人群, 从而混淆下游分析。在没有不必要的细胞剪切和消化的情况下, 温和的分离对于实现高细胞产量和组织组成的准确表示至关重要。剪切力发生在三化、流式细胞仪和再悬浮步骤过程中。3) 与任何 rna 工作一样, 在制备过程中, 最好在样品中引入尽可能少的额外 rnase。这将有助于保持高质量的 rna。使用核糖核酸酶抑制剂溶液与冲洗清洁工具和任何设备, 不是无 rnase, 但避免 depc 处理的产品。4) 尽快做好准备。这将有助于维持高质量的 rna 和减少细胞死亡。根据组织解剖长度和动物数量, 考虑同时开始多项解剖/制剂。5) 尽可能在冰上准备细胞, 以保持高质量的 rna, 减少细胞死亡, 减缓细胞信号和转录活动。尽管, 冰凉处理是大多数细胞类型的理想选择, 但某些细胞类型 (如中性粒细胞) 在室温下加工时表现更好。6) 在细胞制备过程中避免使用钙、镁、edta 和 depc 处理的产品。
该协议演示了单个细胞的适当制备如何揭示数千个单个细胞的转录异质性, 并区分组织内的功能状态或独特的细胞身份。该协议不需要荧光记者蛋白或转基因工具, 可应用于从各种感兴趣的组织 (包括人类组织) 中分离单个细胞;请记住每个组织是独特的, 这个协议将需要一定程度的调整/修改。
细胞内多样化和高度动态的转录程序强调了单细胞基因组学的价值。除了分离高质量的 rna 外, 高质量数据集所必需的一个关键样品制备步骤是确保细胞完全从组织中释放, 并确保细胞健康和完整。这对于收集容易释放的细胞来说是相对直接的, 例如循环细胞或细胞松散保留的组织中, 如淋巴组织中。但这对其他成人组织来说可能是具有挑战性的, 因为高度发达的细胞结构跨越很远的距离, 周围的细胞外基质和经常涉及维持细胞结构的刚性细胞骨架蛋白。即使有适当的分离技术来完全释放细胞, 严格的和往往需要的处理也有可能改变 mrna 的质量和细胞的完整性。此外, 用于酶辅助解离的高温也会影响转录特征29,30。该协议的目的是提出质量控制检查, 使用组织, 如髓鞘成人神经和细胞外基质丰富的成人皮肤, 以证明如何优化可以帮助克服这些障碍。
设计任何 scrna-seq 实验时的一个主要考虑因素是测序深度的选择。测序可以高度多路复用, 读取深度可以从使用 drop-seq2非常低到使用全长 rna-seq 方法 (如 smat-seq) 的多达500万个读数单元14不等。大多数 srna-seq 实验都能检测到中高表达记录, 测序低至 10, 000个读数/细胞, 这通常足以进行细胞类型分类41,42。在试图检测复杂组织中的罕见细胞群时, 浅层测序深度对于节省测序成本很有价值, 在这些组织中, 可能需要数千个细胞来自信地归因稀有人群。但是, 当需要关于基因表达和与微妙转录特征相关的过程的详细信息时, 浅层测序是不够的。目前, 据估计, 细胞中的绝大多数基因是用50万个读基因检测的, 但这可能因协议和组织类型43,44的不同而不同。虽然全长记录测序绕过了组装的需要, 因此可以检测到新的或罕见的拼接变种, 测序成本往往限制了缩放这种方法, 以检查由复杂的组织系统组成的数千个细胞。相反, 3 ‘ 标记的单细胞库 (如本协议中描述的库) 通常具有较低的复杂性, 需要较浅的排序。需要注意的是, 使用所述协议生成的库可以在五个受支持的序列器之一上进行排序: 1) novaseq, 2) hiseq 000千瓦, 3) hiseq 2500 快速运行和高输出, 4) nextseq 500/, 和 5) miseq。
单细胞 rna-seq 的另一种方法是分析单核45中的 rna, 它减少了对精细组织和细胞处理的需求, 同时又保持了单细胞 rna-seq 的一些好处。这种方法可以更快速地处理, 减少 rna 降解, 并采取更极端的措施, 以确保充分释放细胞核, 从而有可能更有信心地捕获代表特定组织内所有细胞的转录剖面。当然, 这只能提供特定细胞内存在的转录活性的一部分, 因此取决于这种方法可能是适当的, 也可能不是适当的实验目标。
除了对给定组织内的细胞身份进行完整的表征外, 对 scrna-seq 数据集最有价值的分析之一是评估 “定义” 细胞群的中间转录状态。这些中介状态可以深入了解已确定群体中细胞之间的谱系关系, 这在传统的批量 rna-seq 方法中是不可能的。目前已经开发了几种 scrna-seq 生物信息工具来阐明这一点。这些工具可以评估癌细胞过渡到癌基因转移状态、干细胞成熟到不同的终命运或免疫细胞在活动状态和静止状态之间穿梭所涉及的过程。细胞中微妙的转录组差异也可能表明血统偏见, 最近开发的生物信息工具, 如 fateid, 可以推断47。由于过渡细胞之间的区别可能很难确定, 因为转录差异可能是微妙的, 更深入的测序可能是必要的46。幸运的是, 如果有兴趣通过在另一个流单元格上重新运行库来进一步探测数据集, 则可以增加浅排序库的覆盖范围。
总之, 该协议提供了一个易于适应的工作流程, 使用户能够在一个实验中对数百到数千个单细胞进行转录。scrna-seq 数据集的最终质量取决于优化的细胞分离、流式细胞仪、cdna 文库生成和原始基因条形码矩阵的解释。为此, 该协议全面概述了所有可以轻松修改的关键步骤, 以便能够对不同的组织类型进行研究。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 ucsna 服务设施的支持人员以及卡尔加里大学的动物护理设施工作人员。我们感谢马特·沃伦廷的生物信息学支持和詹斯·杜鲁西的技术支持。这项工作的资金来自 cihr 赠款 (r. m. 和 j. b.)、cihr j. b. 新研究员奖和艾伯塔省儿童健康研究所研究金 (j. s.)。
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |