Le dosage de l’agrégation de tau décrit dans ce manuscrit imite les caractéristiques prévues en vivo tau mauvais repliement et d’agrégation.
Agrégation de la protéine tau et de la formation de filaments hélicoïdaux appariés sont une caractéristique de la maladie d’Alzheimer et autres tauopathies. Par rapport aux autres protéines associées à des maladies neurodégénératives, la cinétique de l’agrégation signalées in vitro pour la protéine tau sont moins fiables présentant une variabilité relativement élevée. Nous décrivons ici le développement d’un test in vitro l’agrégation qui imite les étapes attendues associées à tau mauvais repliement et agrégation in vivo. Le test utilise l’isoforme de tau plus longue (huTau441) qui contient les insertions acides N-terminal ainsi que quatre domaines de liaison du microtubule (MBD). L’agrégation in vitro est déclenchée par l’ajout d’héparine et suivie en permanence par fluorescence thioflavine T dans un format 96 puits microplaque. L’essai de l’agrégation de tau est hautement reproductible entre les différents puits, runs expérimentaux et des lots de la protéine. L’agrégation mène à tau PHF morphologie qui est très efficace pour la formation de structures fibrillaires de novo de l’ensemencement. Outre son application dans l’étude du mécanisme de tau mauvais repliement et d’agrégation, le dosage en cours est un outil solide pour le dépistage de médicaments pouvant interférer avec la pathogenèse du tau.
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative dévastateur qui désigne l’examen histopathologique par l’accumulation de plaques séniles extracellulaires d’agrégation amyloïde bêta1 et des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires contenant agrégées hyperphosphorylée tau protein2. Tau physiologique est monomérique et présentée comme six isoformes uniques contenant 0-2 inserts bornes N et liaison de microtubules 3 ou 4 domaines3,4 découlant de l’épissage alternatif et une moyenne de 2-3 phosphorylations. On croit que hyperphosphorylée, mauvais repliement et auto-agrégation fibrillaire structures constituent les éléments clés dans la pathogenèse de tau, telle qu’évaluée pathologiquement personnes démentes5,6.
Les enchevêtrements de tau neurofibrillaires agrégées sont une caractéristique non seulement pour AD, mais aussi pour les autres tauopathies, y compris la dégénérescence lobaire fronto-temporale (FTLD), maladie de Pick, paralysie supranucléaire progressive (PSP), démence fronto-temporale (DFT) et primaire liée à l’âge tauopathy (partie)2. D’un point de vue biochimique, comprendre le mécanisme de tau mauvais repliement et l’agrégation pourrait faire la lumière sur les processus pathologiques associés à annonce et autres tauopathies. Outre l’aspect scientifique, robuste en vitro agrégation tests sont des outils précieux pour le dépistage des drogues candidats7,8,9,10. On croit que l’agrégation de tau suit une nucléation dépendant de polymérisation processus (NPD)11,12,13,14. La cinétique du NPD est sigmoïde et commence par une étape de nucléation énergétiquement défavorable suivie d’un processus d’agrégation descente rapide énergiquement.
Contrairement aux autres protéines amyloïdogène, y compris de la protéine prion, la protéine bêta-amyloïde et le α-synucléine, tau ne s’agrège pas spontanément dans des conditions physiologiques et pHs voire extrême ou hautes températures sont non propice pour agrégation15. C’est très probablement en raison des interactions hydrophylic présentes dans l’interface de l’agrégation de tau. Cependant, tau agrège efficacement à des concentrations physiologiques lorsqu’on utilise des inducteurs tels que l’héparine16 ou autres polyanions17,18 .
Les efforts antérieurs de mettre en place en vitro tau agrégation dosages ont nous éclairer sur les détails de la mauvais repliement tau et de l’agrégation, mais ils sont courts d’imiter ce qu’on croit être la cinétique de l’agrégation en vivo tau. Dans la plupart des cas, la cinétique de l’agrégation de tau était absente de la phase de latence initial associée de nucléation de tau. Cela aurait pu être la conséquence de l’utilisation de concentrations de protéine tau très élevé, présence d’agrégats dans les préparations de protéines tau départ et/ou l’utilisation de fragments de tau avec beaucoup propension d’agrégation plus élevée que le tau de pleine longueur plus physiologique protéines19,20,21,22,23. En outre, des études antérieures n’a pas abordé la reproductibilité et l’aspect de robustesse de la cinétique de l’agrégation de tau.
Nous décrivons ici une robuste essai in vitro tau agrégation avec qui imite les caractéristiques principales d’une polymérisation dépendant de nucléation avec une phase de latence initiale correspondant à la nucléation de tau, suivie d’une phase de croissance exponentielle. En outre, les agrégats de tau recombinant générées sont fibrillaires dans la nature et ont une très forte puissance de semis. Le test est très reproductible aussi entre les lots de tau et représente un outil précieux pour dépister les inhibiteurs de l’agrégation.
Malgré de nombreux efforts, la cinétique de l’agrégation de tau rapportées dans la littérature à l’absence de date le niveau désiré de reproductibilité et/ou certaines des caractéristiques d’une nucléation polymérisation dépendante19,20,21 , 22 , 23 , 25. c’est souvent accentué par l’absence d’une phase de latence, le semis inefficace et la nature non fibrillaire des agrégats de tau. La raison de ces lacunes peut varier et comprend la qualité des protéines tau sous-optimal (fragmentation, présence d’agrégats, faible pureté, etc..), choix de protéines et induisant des réactifs et ou les conditions expérimentales. Un autre facteur de complication sont les deux résidus de cystéine situés autour de l’interface d’agrégation tau qui peuvent former intra – ou inter – des ponts disulfure moléculaire selon l’environnement d’oxydo-réduction et affectent l’efficacité de l’agrégation de tau. Dans la plupart des approches réduisant les réactifs tels que TNT ou PTCE ont été utilisées pour maintenir les résidus de cystéine dans formes réduites et ainsi augmenter les niveaux de reproductibilité25. En outre, le coefficient d’extinction du tau est très faible qui conduit à des difficultés pour des mesures précises de concentration de la protéine.
Nous nous sommes concentrés surtout sur quelques paramètres et attributs de qualité que nous avons considéré cruciales pour un profil robuste, reproductible et représentatif de l’agrégation de la protéine tau : éliminer la possibilité d’intra – et inter-formation de disulfure moléculaire, générer un monomère tau très pure et d’améliorer la précision de la détermination de la concentration. Tous ces réactifs associés questions sont des points d’attention possibles que nous avons jugés critiques pour le développement du dosage optimal. Pour résoudre ces problèmes, huTau441 pleine longueur a été exprimée avec deux mutations, C291A et C322A et avec des étiquettes de N – et C-terminale. Mutation des résidus cystéine a un impact minime sur la protéine tau, tout en éliminant les autrement très difficile de contrôler le pont disulfure. Exprimant la protéine avec des tags relativement courte N – et C-terminal nous a permis de poursuivre un protocole de purification d’affinité en deux étapes qui a conduit à très haute pureté, d’intégrité et contenu de monomère. En outre, nous avons introduit une mutation F8W qui augmente le coefficient d’extinction de la protéine et autorisé beaucoup plus précis de mesures de concentration24.
En utilisant des réactifs de protéines de haute qualité, plus d’autres paramètres de dosage ont été également optimisés. Le tau optimale : ratio de l’héparine a été identifiée comme étant environ 0,5 (M/M) qui s’inscrit dans les études déjà publiées,26. En outre, mécaniques et optiques des paramètres instruments sont cruciales pour assurer la reproductibilité et les paramètres optimaux peuvent différer dans une certaine mesure selon le fabricant.
L’agrégation de tau décrit dans ce test montre des caractéristiques qui sont associés à la pathogenèse de tau dans AD et associés tauopathies. Le processus commence par une phase de latence initiale correspondant à la formation des noyaux de haute énergie et est suivi d’une phase de croissance rapide qui correspond à la croissance de la fibrille. Le temps de latence est suffisamment long pour ouvrir une fenêtre large afin d’étudier en détail le processus d’amorçage couvrant une large gamme de concentrations (Figure 5) alors que c’est pas encore trop longtemps afin d’évite la dégradation des protéines et/ou l’agrégation non spécifique de la graine (Figure 2). ces événements secondaires pourraient se produire en particulier lorsqu’une protéine intrinsèquement désordonnée comme huTau441 est exposée pendant de longues périodes de temps à des conditions physiologiques. L’affichage d’agrégats de tau obtenus la morphologie de FHJ isolée du cerveau des patients atteints de ma et sont très efficaces en recrutement tau monomère et convertissant en reprenant générée agrégats, un processus dénommé ensemencement. L’essai est très reproductible, la courbe cinétique étant pratiquement impossible à distinguer entre les puits, runs expérimentaux et des lots de protéines. Bien que le dosage en cours ne porte que sur la plus longue isoformes tau, huTau441, l’application peut être adaptée à l’étude de la conversion d’autres formes de tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica Communications, sous presse) en outre, elle permet des études mécanistes axé sur l’interaction des isoformes tau et éventuellement faire la lumière sur les différences entre la pathogenèse tau dans AD où les 3R et 4R isoformes sont présents dans FHJ et de PICK de maladie ou de la démence frontotemporale où la pathologie tau contient principalement 3R et 4R tau isoformes, respectivement le27.
La très haute reproductibilité du dosage doit permettent aux lecteurs de mettre en œuvre avec une relative facilité à leurs paramètres de laboratoire spécifique. Le dosage imite ce qu’on croit être la en vivo mauvais repliement et l’agrégation de tau, ce qui permet des études mécanistes qui éclairent tau pathogenèse et il constitue un outil précieux pour la présélection des candidats-médicaments et évaluer leur interférence avec les différentes étapes du processus de pathogenèse.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiens à remercier Hector Quirante d’expression et purification de huTau441, Hanna Inganäs et Margot van Winsen excellent support technique et Martin Koldijk pour l’analyse des données.
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |