Vitro Tahlil türleri çalışmak için toplama Tau Protein ve uyuşturucu tarama
Summary
Bu el yazması açıklanan tau toplama tahlil vivo içinde tau misfolding ve toplama beklenen özelliklerini taklit eder.
Abstract
Toplama tau protein ve eşleştirilmiş helisel filamentlerin oluşumunu bir Alzheimer hastalığı ve diğer tauopathies özelliğidir. Nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili diğer proteinler karşılaştırıldığında, bildirilen vitro toplama kinetik tau protein için nispeten yüksek bir çeşitlilik sunan daha az tutarlı. Burada tau misfolding ve toplama içinde vivoile ilişkili beklenen adımları taklit eden bir vitro toplama tahlil gelişimini açıklar. Tahlil de N-terminal asidik ekler gibi dört Mikrotubul bağlayıcı etki alanları (MBD) içeren uzun tau izoformu (huTau441) kullanır. Vitro toplama heparin eklenmesi tarafından tetiklenir ve sürekli thioflavin T floresans 96 iyi Mikroplaka kartvizitlere izledi. Tau toplama tahlil farklı wells, deneysel çalışır ve protein toplu işlemleri arasında son derece tekrarlanabilir. Toplama tau de novo fibriler yapıların oluşumu tohum çok verimli PHF benzeri morfoloji yol açar. Tau misfolding ve toplama mekanizması eğitim uygulaması ek olarak, geçerli tahlil tau patogenezi ile engelleyebilir uyuşturucu süzmek için güçlü bir araçtır.
Introduction
Alzheimer hastalığı histopathologically toplanan amiloid beta1 ekstraselüler senil plak birikimi tarafından tanımlanan bir yıkıcı nörodejeneratif hastalığıdır ve hücre içi neurofibrillary düğüm içeren toplanan hyperphosphorylated tau protein2. Fizyolojik tau monomeric ve altı benzersiz izoformlarının içeren 0-2 olarak sunulan N terminal ekler ve alternatif uçbirleştirme ve ortalama 2-3 fosforilasyon kaynaklanan 3 ya da 4 Mikrotubul bağlayıcı etki alanları3,4 . Bu hyperphosphorylation, misfolding ve fibrillary yapıları içine kendini toplama olarak patolojik olarak değerlendirildi çılgın bireyler5,6tau patogenezinde temel unsuru teşkil inanılıyor.
Toplanan neurofibrillary tau düğüm bir hallmark sadece reklam için aynı zamanda da lobar dejenerasyonu (FTLD), Pick hastalığı, ilerici supranuclear palsi (PSP), fronto-geçici demans (FTD) ve birincil dahil olmak üzere diğer tauopathies vardır yaşa bağlı tauopathy (bölüm)2. Biyokimyasal açıdan, tau misfolding ve toplama mekanizması anlama reklam ile ilgili patolojik işlemlerin ışık ve diğer tauopathies. Bilimsel yönü yanı sıra, sağlam vitro toplama deneyleri uyuşturucu adaylar7,8,9,10ile taranması için değerli araçlardır. Bu tau toplama bir çekirdekleşme bağımlı polimerizasyon süreci (NDP)11,12,13,14izler inanılıyor. .NET Framework kinetik sigmoidal ve hızlı enerjik yokuş aşağı toplama işlemi tarafından izlenen bir enerjik olumsuz çekirdekleşme adım ile başlar.
Prion protein, amiloid beta ve α-synuclein, dahil olmak üzere diğer amyloidogenic proteinler aksine tau kendiliğinden fizyolojik koşullar altında toplamak değil ve hatta aşırı pHs veya yüksek sıcaklık için toplama15sigara elverişli. Bunun en hydrophylic etkileşimleri tau toplama arabiriminde mevcut nedeni olabilir. Ancak, tau olarak verimli bir şekilde indükleyicileri heparin16 veya diğer polyanions17,18 gibi kullanıldığında fizyolojik konsantrasyonları toplar.
Vitro tau toplama deneyleri ayarlamak için önceki çabaları tau misfolding ve toplama ayrıntılarını üzerine biraz ışık, ama ne vivo içinde tau toplama kinetik inanılan taklit eden kısa geldiler. Çoğu durumda, tau toplama kinetik tau çekirdekleşme ile ilişkili başlangıç gecikme aşama eksik oldu. Bu çok yüksek tau protein konsantrasyonları, kullanmanın sonucu başlangıç tau protein hazırlıklar toplamları varlığı ve/veya kullanımı ile çok daha yüksek toplama eğilimi daha fazla fizyolojik tam uzunlukta tau tau parçalarının olabilir protein19,20,21,22,23. Ayrıca, önceki çalışmalarda tekrarlanabilirlik ve tau toplama kinetik sağlamlık yönünü ele vermedi.
Burada, bir çekirdekleşme bağımlı polimerizasyon temel özelliklerinin bir üstel büyüme aşaması gelir tau çekirdekleşme karşılık gelen bir başlangıç gecikme faz ile taklit eden bir sağlam vitro tau toplama tahlil açıklayın. Ayrıca, oluşturulan rekombinant tau toplamları doğada fibriler ve son derece yüksek bir tohumlama etki gücüne sahip. Tahlil de tau gruplar arasında son derece tekrarlanabilir ve değerli bir araç toplama inhibitörleri için ekran temsil eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok sayıda çabalarına rağmen tau toplama kinetik literatürde bildirilen tarih eksikliği tekrarlanabilirlik istenen seviyeye ve/veya bir çekirdekleşme bağımlı polimerizasyon19,20,21 özellikleri , 22 , 23 , 25. bu kez bir gecikme faz, verimsiz tohum ve tau toplamları fibriler sigara doğası eksikliği tarafından vurgulanmaktadır. Bu eksiklikler nedeni değişebilir ve alt-optimal tau protein kalite (parçalanma, varlığı toplamları, düşük saflık, vs.), protein ve reaktifler ve/veya deneysel koşullar inducing seçimi içerir. Başka bir karışıklık faktör Intra – oluştururlar veya Inter tau toplama arabirimi iki sistein artıkları – redoks çevre ve etkiler tau toplama verimliliğini bağlı olarak moleküler disülfür köprü. Çoğu yaklaşımlar reaktifler DTT veya TCEP gibi azaltarak azaltılmış formları sistein kalıntıları korumak için kullanılmış ve böylece tekrarlanabilirlik25düzeylerini artırmak. Ayrıca, tau tükenme katsayısı hangi bir protein konsantrasyonu doğru ölçümler zorluklar yol açar çok düşüktür.
Özellikle birkaç parametreleri ve biz tau protein için sağlam, tekrarlanabilir ve temsilcisi toplama profil için çok önemli olarak kabul kalite öznitelikleri üzerinde duruldu: Intra – olasılığını ortadan kaldırarak ve Inter-moleküler disülfür oluşumu, bir son derece saf tau monomer üreten ve konsantrasyonu tayini doğruluğunu geliştirmek. Bu reaktif ile ilgili sorular biz en iyi tahlil gelişimi için kritik olarak kabul potansiyel ilgi noktalarıdır. Bu sorunlara yönelik olarak tam uzunlukta huTau441 iki mutasyonlar, C291A ve C322A ve N – ve C-terminal Etiketler ile ifade edildi. Mutasyon sistein kalıntıları Aksi takdirde çok zor disülfür köprü denetlemek ayrıcılıklarına tau protein üzerinde çok az etkisi vardır. Protein nispeten kısa N ve C terminali Etiketler ile ifade çok yüksek saflıkta, bütünlüğü ve monomer içerik için yol açan bir iki adım benzeşme arıtma protokolü takip izin verdi. Ayrıca, biz protein yok olma katsayısı arttı ve çok daha doğru konsantrasyon ölçümleri24izin bir F8W mutasyon tanıttı.
Yüksek kaliteli protein reaktifler kullanmanın yanı sıra, diğer tahlil parametreleri de optimize. En iyi tau: heparin oranı tespit doğrultusunda önceden yayınlanmış çalışmaları26olan 0,5 (M/M) yanında olmak. Ayrıca, mekanik ve optik enstrümantal ayarlarını tekrarlanabilirlik ve optimum parametreleri bir dereceye kadar üreticiye bağlı olarak farklı olabilir emin olmak büyük önem taşımaktadır.
Bu tahlil açıklanan tau toplama reklam tau patogenezi ile ilişkili olan ve tauopathies ilgili özellikleri gösterir. Süreci yüksek enerji çekirdeği oluşumu için karşılık gelen bir başlangıç gecikme aşaması ile başlar ve karşılık gelen bir hızlı büyüme aşaması fibriller büyüme için gelir. Öteleme süresini kapsayan geniş bir tohum konsantrasyonları (Şekil 5) hala çok uzun süre protein yıkımı ve/veya non-spesifik toplama kaçınılması böylece tohumlama işlemi (Şekil ayrıntılı olarak incelemek için geniş bir pencere açmak için yeterince uzun 2). huTau441 gibi özünde düzensiz bir protein için uzun dönem-in zaman fizyolojik koşullarına maruz kaldığında bu ikincil olaylar özellikle olabilir. PHFs morfoloji reklam hastaların beyin izole ve monomeric tau işe ve de novo için dönüştürme çok verimli elde edilen tau toplamları görüntüleme toplamları, tohum olarak adlandırılan bir süreç oluşturulur. Tahlil kinetik eğrileri wells, deneysel çalışır ve protein toplu işlemleri arasında neredeyse ayırt edilemez olmak son derece tekrarlanabilir. Sadece en uzun tau izoformu, huTau441, geçerli tahlil odaklanır, ancak uygulama adapte edilebilir tau (Ameijde ve ark., Acta Neuropathologica iletişim, basında) diğer formları dönüşüm eğitim için Ayrıca, bu sağlar Mekanik çalışmaları tau izoformlarının etkileşimi üzerinde duruldu ve muhtemelen nerede 3R ve 4R izoformlarının burada tau patoloji esas olarak içeren PHFs ve PICK hastalığı veya da demans yoksa reklam patogenezinde tau arasındaki farklar ışık 3R ve 4R tau izoformlarının, sırasıyla27.
Tahlil çok yüksek tekrarlanabilirlik okuyucular belirli laboratuvar ayarlarına göreli kolaylıkla uygulamak izin vermelidir. Tahlil ne vivo içinde misfolding ve tau agregasyon inanılıyor taklit eder, tau patogenez ve bu ışık tutacak mekanik çalışmalar etkinleştirme ilaç adaylarının süzmek için değerli bir araç teşkil eder ve onların girişim değerlendirmek Patogenez işleminin farklı adımları ile.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Hector Quirante ifade ve huTau441, arınma için Hanna Inganäs ve mükemmel teknik destek için Margot van Winsen ve Martin Koldijk veri analizi için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
| PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
| 0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
| 0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
| 96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
| Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
| Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
| Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |
Riferimenti
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
- Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
- Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
- Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
- Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer’s disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
- Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
- Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer’s disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
- Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
- Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
- Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
- Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochimica. 44 (48), 15880-15888 (2005).
- Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), E4376-E4385 (2014).
- Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
- Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochimica. 47 (40), 10526-10539 (2008).
- Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
- Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer’s disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
- Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochimica. 41 (50), 14885-14896 (2002).
- Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochimica. 37 (28), 10223-10230 (1998).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer’s disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochimica. 52 (40), 6960-6967 (2013).
- Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer’s disease and the tauopathies. Biochimica. 52 (24), 4107-4126 (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
- Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
- Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick’s disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).
