Tau aggregering analysen beskrevet i dette manuskriptet etterligner etterlengtede funksjonene i vivo tau misfolding og aggregering.
Samling av tau protein og dannelse av sammenkoblede spiralformede filamenter er et kjennetegn på Alzheimers sykdom og andre tauopathies. Sammenlignet med andre proteiner tilknyttet nevrodegenerative sykdommer, aggregering rapportert i vitro kinetics for tau protein er mindre konsekvente presenterer en relativt høy variasjon. Her beskrive vi utviklingen av i vitro aggregering analysen som etterligner forventet trinnene knyttet tau misfolding og aggregering i vivo. Analysen bruker de lengste tau isoformen (huTau441) som inneholder både N-terminal surt setter samt fire microtubule binding domener (MBD). I vitro aggregasjonen er utløst av tillegg av heparin og kontinuerlig etterfulgt av thioflavin T fluorescens i 96 godt microplate format. Tau aggregering analysen er svært reproduserbar mellom forskjellige brønner, eksperimentelle kjører og grupper av protein. Aggregering fører til tau PHF-lignende morfologi som er svært effektiv i seeding dannelsen av de novo fibrillar strukturer. I tillegg til sin søknad i å studere mekanismen av tau misfolding og aggregering, er gjeldende analysen et kraftig verktøy for screening legemidler som kan forstyrre patogenesen av tau.
Alzheimers sykdom er en ødeleggende nevrodegenerativ lidelse histopathologically definert av akkumulering av ekstracellulære senil plaketter av aggregert Amyloid beta1 og intracellulær neurofibrillary ledninger som inneholder samlet hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiske tau er monomerisk og presentert som seks unike isoformene som inneholder 0-2 N terminal INSERT og 3 eller 4 microtubule binding domener3,4 som følge av alternativ skjøting og et gjennomsnitt på 2-3 phosphorylations. Det antas at hyperphosphorylation, misfolding og selv samling i fibrillary strukturer utgjør de viktigste elementene i tau patogenesen, som pathologically vurdert i demente enkeltpersoner5,6.
De aggregerte neurofibrillary tau floker er et kjennetegn ikke bare for Annonsen, men også for andre tauopathies, inkludert frontotemporal lobar degenerasjon (FTLD), Pick sykdom, progressiv supranuclear parese (PSP), fronto-temporal demens (FTD) og primær Age-relaterte tauopathy (del)2. Fra en biokjemiske synspunkt, forstå mekanismen av tau misfolding og aggregering kunne kaste lys over patologisk prosesser knyttet til Annonsen og andre tauopathies. Det vitenskapelige aspektet er robust i vitro aggregering analyser verdifulle verktøy for screening av narkotika kandidater7,8,9,10. Det antas at aggregering av tau følger en nucleation avhengige polymerisasjon prosessen (NDP)11,12,13,14. NDP kinetics er sigmoidal og starter med en energisk ugunstige nucleation trinn etterfulgt av en rask energisk nedoverbakke aggregering prosess.
I motsetning til andre amyloidogenic proteiner, inkludert prion protein, amyloid beta og α-synuclein, tau spontant samlet ikke under fysiologiske forhold og selv ekstreme pHs eller høye temperaturer er ikke-bidro samling15. Dette skyldes sannsynligvis hydrophylic vekselsvirkningene i tau aggregering grensesnittet. Imidlertid samler tau effektivt i fysiologiske konsentrasjoner Når indusere som heparin16 eller17,18 andre polyanions brukes.
Tidligere innsats å sette opp i vitro tau aggregering analyser har kaste lys på detaljene i tau misfolding og aggregering, men de kom kort av etterligne hva antas å være i vivo tau aggregering kinetics. I de fleste tilfeller manglet tau aggregering kinetics den første lag fasen knyttet tau nucleation. Dette kan ha vært konsekvensen av å bruke svært høy tau protein konsentrasjoner, tilstedeværelse av aggregater i Start tau protein forberedelsene og/eller bruk av tau med mye høyere aggregering tilbøyelighet enn den mer fysiologiske full lengde tau protein19,20,21,22,23. Videre opp tidligere studier ikke reproduserbarhet og robusthet del av tau aggregering kinetics.
Her beskriver vi en robust i vitro tau aggregering analysen som etterligner hovedegenskapene for en nucleation avhengige polymerisasjon med en første lag fase tilsvarer tau nucleation etterfulgt av en eksponentiell vekstfase. Videre genererte rekombinant tau aggregater er fibrillar i naturen og har en ekstremt høy seeding styrke. Analysen er svært reproduserbar mellom tau grupper og representerer et verdifullt verktøy til skjermen for aggregering hemmere.
Til tross for utallige forsøk, tau aggregering kinetics rapportert i litteraturen dato mangel ønsket nivået av reproduserbarhet og/eller noen av funksjonene i nucleation avhengige polymerisasjon19,20,21 , 22 , 23 , 25. Dette er ofte understreket av mangel på et lag fase, ineffektiv såing og ikke-fibrillar natur tau aggregat. Årsaken til disse manglene kan variere og inkluderer sub-optimal tau protein kvalitet (fragmentering, tilstedeværelse av aggregater, lav renhet, osv.), valg av protein og inducing reagenser og eksperimentelle forhold. En kompliserende faktor er to cystein rester ligger rundt tau aggregering grensesnittet som kan danne intra – eller inter – molekylær disulfide broer avhengig av redoks miljø og påvirke effektiviteten av tau aggregering. I de fleste tilnærminger redusere reagenser som DTT eller TCEP har blitt brukt til å opprettholde cystein rester i redusert former og dermed øke nivåer av reproduserbarhet25. Videre er utryddelse koeffisient tau svært lav som fører til problemer i nøyaktige målinger av protein konsentrasjon.
Vi fokuserer spesielt på noen parametere og kvalitet attributter som vi anses avgjørende for en robust, reproduserbare og representant aggregering profil for tau protein: eliminerer muligheten for intra – og inter-molekylær disulfide formasjon, generere en svært ren tau monomer og forbedre nøyaktigheten av konsentrasjon besluttsomhet. Alle disse reagens knyttet spørsmål oppmerksomhet steder som vi som kritisk for optimal analysen utvikling. For å løse disse problemene, ble full lengde huTau441 uttrykt med to mutasjoner, C291A og C322A, og med N – og C-terminalen koder. Mutasjon av cystein rester har minimal innvirkning på tau protein mens de eliminerer den ellers veldig vanskelig å kontrollere disulfide broer. Uttrykke protein med relativt kort N – og C-terminalen koder tillot oss å forfølge en totrinns affinitet rensing protokoll som førte til høy renhet, integritet og monomer innhold. Videre har innført vi en F8W mutasjon som økt utryddelse koeffisient av protein og tillot mye mer nøyaktig konsentrasjon målinger24.
I tillegg til høy-kvalitet protein reagenser, var uteffekt analysen også optimalisert. Den optimale tau: heparin forholdet ble identifisert for å være rundt 0,5 (M/M) som er i tråd med tidligere publiserte undersøkelser26. Videre er mekanisk og optisk instrumental innstillinger avgjørende å sikre reproduserbarhet og optimale parametere avvike i noen grad avhengig av produsenten.
Aggregering av tau beskrevet i denne analysen viser egenskapene som er knyttet til tau patogenesen i AD og relaterte tauopathies. Prosessen starter med en første lag fase tilsvarer dannelsen av høy energi kjerner og etterfølges av en rask vekstfase som svarer til fibril vekst. Forsinkelse er tilstrekkelig lang til å åpne en bred vindu for å studere i detalj seeding prosessen som dekker et bredt spekter av frø konsentrasjoner (figur 5) mens fortsatt ikke for lenge så protein fornedrelse og/eller ikke-spesifikk aggregering unngås (figur 2). Disse sekundære hendelsene kan spesielt skje når en bunn uordnede protein som huTau441 blir utsatt for lange perioder fysiologiske forhold. Innhentet tau aggregater skjermen morfologi av PHFs isolert fra hjernen til AD pasienter og er svært effektiv i å rekruttere monomerisk tau og konvertere den til de novo generert aggregat, en prosess som frø. Analysen er svært reproduserbare, kinetisk kurvene blir nesten utvisket mellom brønner, eksperimentelle kjører og protein bunker. Selv om gjeldende analysen fokuserer bare på den lengste tau isoformen, huTau441, programmet kan tilpasses for å studere konvertering av andre former for tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikasjon, i trykk) videre kan mekanistisk studier fokuserte på samspillet mellom tau isoformene og muligens kaste lys over forskjellene mellom tau patogenesen i AD hvor både 3R og 4R isoformene er i PHFs og PICK sykdom eller Frontotemporal demens der tau patologi inneholder hovedsakelig 3r og 4R tau isoformene, henholdsvis27.
Den svært høy reproduserbarhet til analysen bør tillate leserne å iverksette den med relativ letthet i bestemte lab innstillingene. Analysen etterligner det som antas å være i vivo misfolding og aggregering av tau, aktivere mekanistisk studier som vil kaste lys over tau patogenesen og det er et verdifullt verktøy for screening narkotika kandidater og vurdere deres forstyrrelser med de ulike trinnene i patogenesen prosessen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Hector Quirante for uttrykk og rensing av huTau441, Hanna Inganäs og Margot van Winsen utmerket kundestøtte og Martin Koldijk for dataanalyse.
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |