Tau sammenlægning analysen beskrives i dette manuskript efterligner de forventede funktioner i vivo tau misfoldning og sammenlægning.
Sammenlægning af tau protein og dannelsen af parret spiralformet filamenter er kendetegnende for Alzheimers sygdom og andre tauopathies. Sammenlignet med andre proteiner, der er forbundet med neurodegenerative sygdomme, rapporterede i vitro sammenlægning kinetik for tau protein er mindre konsekvent præsenterer en relativt høj variabilitet. Her beskriver vi udviklingen af et in vitro- sammenlægning forsøg, der efterligner den forventede foranstaltninger forbundet med tau misfoldning og sammenlægning in vivo. Analysen benytter den længste tau isoform (huTau441), som indeholder både N-terminale sure skær samt fire mikrotubulus bindende domæner (MBD). In vitro- sammenlægning er udløst af tilsætning af heparin og følges løbende af thioflavin T fluorescens i en 96 godt mikrotiterplade format. Tau sammenlægning assay er yderst reproducerbare mellem forskellige brønde, eksperimentelle løber og partier af proteinet. Sammenlægning fører til tau PHF-lignende morfologi, som er meget effektiv i såning dannelsen af de novo fibrillar strukturer. Ud over dets anvendelse i at studere mekanismen af tau misfoldning og sammenlægning, er den nuværende assay en robust værktøj til screening af lægemidler, der kan forstyrre patogenesen af tau.
Alzheimers sygdom er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der er histopathologically defineret af ophobning af ekstracellulære senile plaques aggregerede Amyloid beta1 og intracellulære neurofibrillary tangles der indeholder aggregerede hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiske tau er monomere og præsenteres som seks unikke isoformer indeholdende 0-2 N terminal skær og 3 eller 4 mikrotubulus bindende domæner3,4 fra alternativ splicing og et gennemsnit på 2-3 phosphorylations. Det menes, at hyperphosphorylation, misfoldning og selvstændig sammenlægning i fibrillære strukturer udgør de centrale elementer i tau patogenese, som patologisk vurderet i demente personer5,6.
De aggregerede neurofibrillary tau tangles er kendetegnende for Annoncen, men også for andre tauopathies, herunder frontotemporal lobar degeneration (FTLD), picks sygdom, progressiv supranuclear parese (PSP), fronto-temporale demens (FTD) og primære aldersrelaterede tauopathy (del)2. Fra biokemiske forstå mekanisme af tau misfoldning og sammenlægning kunne kaste lys over de patologiske processer forbundet med annonce og andre tauopathies. Ud over det videnskabelige aspekt er robust in vitro- sammenlægning assays værdifulde værktøjer til screening af drug kandidater7,8,9,10. Det menes, at en sammenlægning af tau følger en Nukleering afhængige polymerisering proces (NUP)11,12,13,14. NDP kinetik er sigmoide og starter med en energisk ugunstige Nukleering skridt efterfulgt af et hurtigt energisk downhill sammenlægning proces.
I modsætning til andre amyloidogenic proteiner, herunder prionprotein, amyloid beta og α-synuclein, tau spontant samlet ikke under fysiologiske forhold og endda ekstreme pHs eller høje temperaturer er ikke befordrende for sammenlægning15. Dette er sandsynligvis på grund af hydrophylic interaktioner i grænsefladen tau sammenlægning. Men aggregater tau effektivt på fysiologiske koncentrationer ved anvendelsen af induktorer såsom heparin16 eller andre polyanions17,18 .
Tidligere bestræbelser på at oprette in vitro- tau sammenlægning assays har kaste lys ind på detaljerne i tau misfoldning og sammenlægning, men de kom kort af efterligne, hvad der menes at være i vivo tau sammenlægning kinetik. I de fleste tilfælde manglede tau sammenlægning kinetik den indledende forsinkelse fase tilknyttet tau Nukleering. Dette kunne have været en følge af ved hjælp af meget høj tau protein fusioner, tilstedeværelsen af aggregater i udgangspunktet tau protein præparater og/eller brug af tau fragmenter med meget højere sammenlægning tilbøjelighed end de mere fysiologiske fuld længde tau protein19,20,21,22,23. Desuden adresse tidligere undersøgelser ikke reproducerbarhed og robusthed aspekt af tau sammenlægning kinetik.
Her, beskriver vi en robust in vitro- tau sammenlægning assay som efterligner de vigtigste karakteristika ved en Nukleering afhængigt af polymerisering med en indledende forsinkelse fase svarende til tau Nukleering efterfulgt af en eksponentiel vækstfase. Desuden, de genererede rekombinant tau aggregater er fibrillar i naturen og har en ekstremt høj seeding potens. Analysen er yderst reproducerbare også mellem tau partier og repræsenterer et værdifuldt redskab til at screene for sammenlægning hæmmere.
Trods talrige bestræbelser, tau sammenlægning kinetik rapporteret i litteraturen til dato mangler det ønskede niveau af reproducerbarhed og/eller nogle af funktionerne i en Nukleering afhængige polymerisering19,20,21 , 22 , 23 , 25. det understreges ofte af manglen på en mellemliggende fase, ineffektive såning og ikke-fibrillar natur af tau aggregater. Årsagen til disse mangler kan variere og omfatter sub-optimale tau protein kvalitet (fragmentering, tilstedeværelsen af aggregater, lav renhed, osv.), valg af protein og overtalelse reagenser og eller forsøgsbetingelser. En anden komplicerende faktor er de to cystein restkoncentrationer placeret omkring tau sammenlægning interface, der kan danne intra – eller inter – Molekylær disulfid broer afhængigt af redox miljø og påvirke effektiviteten af tau sammenlægning. I de fleste tilgange reducerer reagenser som DTT eller TCEP har været brugt til at opretholde cystein restkoncentrationer i reducerede former og dermed øge niveauet af reproducerbarhed25. Desuden er extinction koefficient af tau meget lav, som fører til vanskeligheder med nøjagtige målinger af proteinkoncentration.
Vi fokuserede især på et par parametre og kvalitetsegenskaber, som vi anses for afgørende for en robust, reproducerbare og repræsentative sammenlægning profil for tau protein: at eliminere muligheden for intra – og inter-Molekylær disulfid dannelse, generere en meget ren tau monomer og forbedre nøjagtigheden af koncentration bestemmelse. Alle disse reagens-relaterede spørgsmål er potentielle opmærksomhed punkter, som vi anses for afgørende for optimal assay udvikling. For at løse disse problemer, blev fuld længde huTau441 udtrykt med to mutationer, C291A og C322A, og N – og C-terminale tags. Mutation af cystein restprodukter har minimal indvirkning på tau protein samtidig fjerne den ellers meget vanskeligt at kontrollere disulfid broer. Udtrykker proteinet med relativt korte N – og C-terminale tags tillod os at forfølge en to-trins affinitet rensning protokol, hvilket førte til meget høj renhed, integritet og monomer indhold. Desuden indførte vi en F8W mutation, der steg extinction koefficient af protein og tilladt langt mere nøjagtige koncentration målinger24.
Ud over at bruge høj kvalitet protein reagenser, var andre assay parametre også optimeret. Den optimale tau: heparin forholdet var identificeret til at være omkring 0,5 (M/M), som er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser26. Desuden, mekanisk og optisk instrumental indstillinger er afgørende for at sikre, at reproducerbarhed og de optimale parametre kan varierer til en vis grad afhængigt af producenten.
Sammenlægning af tau beskrevet i denne analyse viser karakteristika, der er forbundet med tau patogenese i annonce og relaterede tauopathies. Processen starter med en indledende forsinkelse fase svarende til dannelsen af høj energi kerner og er efterfulgt af en hurtig vækstfase, der svarer til fibril vækst. Den mellemliggende tid er tilstrækkelig lang til at åbne en bred vindue for at studere i detaljer seeding processen, der dækker en bred vifte af frø koncentrationer (figur 5) mens stadig ikke alt for længe så protein nedbrydning og/eller ikke-specifikke sammenlægning undgås (figur 2). disse sekundære begivenheder kan især ske, når et uløseligt uordnede protein som huTau441 er udsat for lange perioder til fysiologiske tilstande. Opnåede tau aggregater display morfologi af PHFs isoleret fra hjernen hos AD patienter og er meget effektiv i at rekruttere monomere tau og konvertere den til de novo genereret aggregater, en proces kaldet såning. Analysen er yderst reproducerbar, kinetic kurver er stort set umulig at skelne mellem brønde, eksperimentelle løber og protein partier. Selv om den aktuelle analyse fokuserer kun på de længste tau isoform, huTau441, anvendelsen kan tilpasses til at studere konvertering af andre former for tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikation, i pressen) Desuden, det giver Mekanistiske undersøgelser fokuseret på samspillet mellem tau isoformer og eventuelt kaste lys over forskellene mellem tau patogenese i annonce hvor både 3R og 4R isoformer er til stede i PHFs og picks sygdom eller Frontotemporal demens hvor tau patologi indeholder primært 3R og 4R tau isoformer, henholdsvis27.
Meget høj reproducerbarhed af analysen bør tillade læsere til at gennemføre det med relativ lethed i deres specifikke lab indstillinger. Analysen efterligner Hvad menes at være i vivo misfoldning og sammenlægning af tau, at aktivere Mekanistiske undersøgelser, som vil kaste lys over tau patogenese, og det udgør et værdifuldt redskab til screening af lægemiddelkandidater og evaluere deres indblanding med de forskellige trin i patogenesen proces.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Hector Quirante for den proteinekspression og -oprensning af huTau441, Hanna Inganäs og Margot van Winsen for fremragende teknisk support og Martin Koldijk til dataanalyse.
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |