ताऊ का एकत्रीकरण परख इस पांडुलिपि में वर्णित vivo ताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण में की प्रत्याशित सुविधाओं की नकल ।
ताऊ प्रोटीन का समुच्चय और युग्मित पेचदार रेशा का गठन अल्जाइमर रोग और अन्य tauopathies की एक बानगी है । neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े अन्य प्रोटीन की तुलना में रिपोर्ट इन विट्रो एकत्रीकरण कैनेटीक्स ताऊ प्रोटीन के लिए कम संगत एक अपेक्षाकृत उच्च परिवर्तनशीलता पेश कर रहे हैं. यहाँ हम में एक के विकास का वर्णन इन विट्रो एकत्रीकरण परख कि vivo मेंताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण के साथ जुड़े अपेक्षित कदम की नकल । परख सबसे लंबे समय तक ताऊ isoform (huTau441) का उपयोग करता है जो दोनों एन टर्मिनल अंलीय आवेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चार microtubule बंधन डोमेन (MBD) शामिल हैं । इन विट्रो एकत्रीकरण हेपरिन के अलावा द्वारा ट्रिगर किया जाता है और लगातार thioflavin टी प्रतिदीप्ति द्वारा एक ९६ अच्छी तरह से microplate प्रारूप में पीछा किया । ताऊ एकत्रीकरण परख विभिंन कुओं, प्रायोगिक चलाता है और प्रोटीन के बैचों के बीच अत्यधिक reproducible है । एकत्रीकरण ताऊ PHF-की तरह आकृति विज्ञान जो डी नोवो fibrillar संरचनाओं के गठन बोने में बहुत कुशल है की ओर जाता है । ताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण के तंत्र का अध्ययन करने में अपने आवेदन के अलावा, वर्तमान परख है कि ताऊ की रोगजनन के साथ हस्तक्षेप कर सकता दवाओं स्क्रीनिंग के लिए एक मजबूत उपकरण है ।
अल्जाइमर रोग एक विनाशकारी neurodegenerative विकार है कि एकीकृत Amyloid बीटा1 और intracellular neurofibrillary पेचीदा युक्त extracellular बूढ़ा सजीले टुकड़े के संचय द्वारा परिभाषित histopathologically है है hyperphosphorylated तौ प्रोटीन2. शारीरिक ताऊ monomeric है और 0-2 एन टर्मिनल आवेषण और 3 या 4 microtubule बाध्यकारी डोमेन3,वैकल्पिक ब्याह से उत्पंन होने वाले4 और 2-3 phosphorylations के एक औसत युक्त छह अद्वितीय isoforms के रूप में प्रस्तुत किया । यह माना जाता है कि hyperphosphorylation, खुलासा और fibrillary संरचनाओं में स्वयं एकत्रीकरण ताऊ रोगजनन में प्रमुख तत्वों का गठन, के रूप में रोग पागल व्यक्तियों में मूल्यांकन5,6।
एकत्रित neurofibrillary ताऊ पेचीदा न केवल विज्ञापन के लिए, लेकिन यह भी frontotemporal लोबार अध (FTLD) सहित अंय tauopathies के लिए एक बानगी है, उठाओ रोग, प्रगतिशील supranuclear पक्षाघात (PSP), fronto-लौकिक मनोभ्रंश (FTD) और प्राथमिक आयु संबंधी tauopathy (भाग)2. देखने के एक जैव रासायनिक बिंदु से, ताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण के तंत्र को समझना विज्ञापन और अन्य tauopathies के साथ जुड़े रोग प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालता सकता है. वैज्ञानिक पहलू के अलावा, इन विट्रो एकत्रीकरण परख में मजबूत दवा उम्मीदवारों7,8,9,10की स्क्रीनिंग के लिए मूल्यवान उपकरण हैं । ऐसा माना जाता है कि ताऊ का एकत्रीकरण एक nucleation आश्रित बहुलकीकरण प्रक्रिया (एनडीपी)11,12,13,14के बाद होता है । एनडीपी कैनेटीक्स sigmoidal है और एक तेजी से ऊर्जावान डाउनहिल एकत्रीकरण प्रक्रिया के बाद एक ऊर्जावान प्रतिकूल nucleation कदम के साथ शुरू होता है ।
prion प्रोटीन, amyloid बीटा और α-synuclein सहित अन्य amyloidogenic प्रोटीन के विपरीत, ताऊ सहज रूप से शारीरिक स्थितियों के तहत समग्र नहीं करता है और यहां तक कि चरम पीएचएस या उच्च तापमान एकत्रीकरण के लिए गैर-अनुकूल है15. यह सबसे शायद ताऊ एकत्रीकरण इंटरफेस में मौजूद hydrophylic इंटरैक्शन के कारण है. हालांकि, हेपरिन16 या अन्य polyanions17,18 जैसे उत्प्रेरण जब शारीरिक सांद्रता में ताऊ समुच्चय कुशलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा रहा है.
पिछले प्रयासों में स्थापित करने के लिए इन विट्रो ताऊ एकत्रीकरण परख ताऊ के विवरण पर कुछ प्रकाश डाला है खुलासा और एकत्रीकरण, लेकिन वे नकल उतार क्या vivo ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स में माना जाता है की कमी आई । ज्यादातर मामलों में ताऊ के एकत्रीकरण कैनेटीक्स में ताऊ nucleation के साथ जुड़े शुरुआती लैग फेज की कमी थी । यह बहुत उच्च ताऊ प्रोटीन सांद्रता का उपयोग करने का परिणाम हो सकता है, शुरू ताऊ प्रोटीन की तैयारी और/या अधिक शारीरिक पूर्ण लंबाई ताऊ की तुलना में बहुत अधिक एकत्रीकरण प्रवृत्ति के साथ ताऊ टुकड़े का उपयोग में समुच्चय की उपस्थिति प्रोटीन19,20,21,22,23। इसके अलावा, पिछले अध्ययन ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स के reproducibility और मजबूती पहलू को संबोधित नहीं किया ।
यहां, हम में एक मजबूत का वर्णन इन विट्रो ताऊ एकत्रीकरण परख जो एक प्रारंभिक अंतराल के साथ एक nucleation निर्भर बहुलकीकरण के मुख्य विशेषताओं की नकल करता है ताऊ nucleation एक घातीय वृद्धि चरण द्वारा पीछा किया । इसके अलावा, उत्पंन रिकॉमबिनेंट ताऊ समुच्चय प्रकृति में fibrillar है और एक अत्यंत उच्च बोने की शक्ति है । परख भी ताऊ बैचों के बीच अत्यधिक reproducible है और एकत्रीकरण अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।
कई प्रयासों के बावजूद, ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स रिपोर्ट करने के लिए साहित्य में reproducibility के वांछित स्तर की कमी और/या एक nucleation आश्रित की सुविधाओं में से कुछ बहुलकीकरण19,20,21 , 22 , 23 , 25. इस पर अक्सर एक लैग फेज की कमी, ताऊ समुच्चय के अकुशल सीडिंग और नॉन-fibrillar नेचर पर जोर दिया जाता है । इन कमियों के कारण भिंन हो सकते है और उप इष्टतम ताऊ प्रोटीन गुणवत्ता (विखंडन, समुच्चय की उपस्थिति, कम शुद्धता, आदि), प्रोटीन और उत्प्रेरण रिएजेंट और या प्रयोगात्मक शर्तों के विकल्प शामिल हैं । एक अन्य जटिल कारक दो cysteine अवशेषों ताऊ एकत्रीकरण अंतरफलक है कि इंट्रा या अंतर आणविक डाइसल्फ़ाइड पुलों के redox वातावरण पर निर्भर करता है और ताऊ एकत्रीकरण की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं के आसपास स्थित हैं । ऐसे डीटीटी या TCEP के रूप में रिएजेंट को कम करने के दृष्टिकोण में कम रूपों में cysteine अवशेषों को बनाए रखने और इस प्रकार reproducibility25के स्तर में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, ताऊ के विलुप्त गुणांक बहुत कम है जो प्रोटीन एकाग्रता की सटीक माप में कठिनाइयों की ओर जाता है ।
हम विशेष रूप से कुछ मापदंडों और गुणवत्ता विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित किया है कि हम ताऊ प्रोटीन के लिए एक मजबूत, reproducible और प्रतिनिधि एकत्रीकरण प्रोफ़ाइल के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है: अंतर और अंतर आणविक डाइसल्फ़ाइड गठन की संभावना को नष्ट करने, एक अत्यधिक शुद्ध ताऊ मोनोमर पैदा करने और एकाग्रता दृढ़ संकल्प की सटीकता में सुधार । इन सभी एजेंट संबंधित सवाल संभावित ध्यान कहते है कि हम इष्टतम परख विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है । इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, पूर्ण लंबाई huTau441 दो उत्परिवर्तनों, C291A और C322A के साथ व्यक्त किया गया था, और एन के साथ-और सी-टर्मिनल टैग । cysteine अवशेषों के उत्परिवर्तन से ताऊ प्रोटीन पर कम प्रभाव पड़ता है, जबकि डाइसल्फ़ाइड ब्रिजिंग को नियंत्रित करने के लिए अन्यथा बहुत मुश्किल को दूर करते हैं । अपेक्षाकृत कम N और सी के साथ प्रोटीन एक्सप्रेस-टर्मिनल टैग हमें एक दो कदम समानता शुद्धि प्रोटोकॉल जो बहुत उच्च शुद्धता, अखंडता और मोनोमर सामग्री के लिए नेतृत्व को आगे बढ़ाने की अनुमति दी । इसके अलावा, हम एक F8W उत्परिवर्तन कि प्रोटीन के विलुप्त होने गुणांक वृद्धि की शुरुआत की और अधिक सटीक एकाग्रता24माप की अनुमति दी ।
उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन रिएजेंट का उपयोग करने के अलावा, अंय परख मानकों को भी अनुकूलित किया गया । इष्टतम ताऊ: हेपरिन अनुपात के आसपास ०.५ (एम/एम) जो पहले से प्रकाशित अध्ययन26के साथ कतार में है की पहचान की थी । इसके अलावा, यांत्रिक और ऑप्टिकल वाद्य सेटिंग्स reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और इष्टतम मापदंडों निर्माता के आधार पर कुछ हद तक अलग हो सकता है ।
इस परख में वर्णित ताऊ का एकत्रीकरण उन विशेषताओं से पता चलता है जो कि AD और related tauopathies में ताऊ रोगजनन से जुड़े हैं । प्रक्रिया एक प्रारंभिक अंतराल उच्च ऊर्जा नाभिक के गठन के लिए इसी चरण के साथ शुरू होता है और एक तेजी से विकास चरण है कि फाइब्रिल विकास से मेल खाती है के बाद है । अंतराल समय पर्याप्त बीज सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर बोने की प्रक्रिया के विस्तार में अध्ययन करने के लिए एक व्यापक विंडो खोलने के लिए लंबा है (चित्रा 5), जबकि अभी भी बहुत लंबा नहीं है तो प्रोटीन क्षरण और/या गैर विशिष्ट एकत्रीकरण बचा रहे है (चित्रा 2). इन माध्यमिक घटनाओं विशेष रूप से हो सकता है जब एक आंतरिक रूप से huTau441 जैसे प्रोटीन शारीरिक स्थितियों के लिए समय की लंबी अवधि के लिए उजागर होता है । प्राप्त ताऊ समुच्चय विज्ञापन रोगियों के दिमाग से अलग PHFs की आकृति विज्ञान प्रदर्शित और monomeric ताऊ की भर्ती में बहुत कुशल है और यह डी नोवो उत्पंन समुच्चय को बदलने, एक प्रक्रिया बोने के रूप में भेजा । परख अत्यधिक reproducible, काइनेटिक घटता कुओं, प्रयोगात्मक रन और प्रोटीन बैचों के बीच लगभग भेद किया जा रहा है । हालांकि वर्तमान परख केवल सबसे लंबे समय तक ताऊ isoform, huTau441 पर केंद्रित है, आवेदन के लिए ताऊ के अंय रूपों के रूपांतरण का अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है (Ameijde एट अल., Acta Neuropathologica संचार, प्रेस में) इसके अलावा, यह सक्षम बनाता है यंत्रवत अध्ययन ताऊ isoforms के नाटक पर ध्यान केंद्रित किया और संभवत: विज्ञापन में ताऊ रोगजनन के बीच मतभेद पर प्रकाश डाला जहां दोनों 3R और 4R isoforms PHFs और विध की बीमारी या Frontotemporal डिमेंशिया में मौजूद हैं जहां ताऊ पैथोलॉजी में मुख्यत 3R व 4R तौ isoforms, क्रमशः२७.
बहुत उच्च परख के reproducibility पाठकों को यह उनके विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग्स में रिश्तेदार आसानी से लागू करने की अनुमति चाहिए । परख की नकल करता है क्या माना जा रहा है vivo में खुलासा और ताऊ के एकत्रीकरण, यंत्रवत अध्ययन है कि ताऊ रोगजनन पर प्रकाश डाला जाएगा सक्षम करने और यह दवा उंमीदवारों स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का गठन और उनके हस्तक्षेप का मूल्यांकन रोगजनन प्रक्रिया के विभिंन चरणों के साथ ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और डेटा विश्लेषण के लिए मार्टिन Winsen के लिए huTau441, हैना Inganäs और मार्गोट वान Koldijk की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए हेक्टर Quirante शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | dry powder (Mw = 318.86 g/mol) |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | dry powder (Mw = 17-19 kDa) |
TCEP | Sigma-Aldrich | 75259-1G | dry powder (MW= 286.65 g/mol) |
PBS | Gibco-Life Technologies | 10010-015 | Sterile, pH 7.4 (1X) |
0.22 μm sterile filter | Corning | 431160 | PES membrane |
0.20 μm sterile serynge filter | Corning | 431229 | PES membrane |
96-well microplates | Thermo Scientific | 9502867 | Black, flat botton |
Microplate sealers | R&D Systems | DY992 | Adhesive strips |
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader | Biotek | Synergy Neo2 | Hybrid Technology, Gen5 Software |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | 1,5 ml tubes |
Ultrasonics-Branson SFX250 | Branson | 101-063-966R | 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip |