Summary

Analyse des anomalies induite par la β-amyloïde sur Structure de caillot de fibrine par spectroscopie et microscopie électronique à balayage

Published: November 30, 2018
doi:

Summary

Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.

Abstract

Cet article présente des méthodes pour générer des caillots de fibrine di vitro et analyser l’effet de la protéine de bêta-amyloïde (Aß) sur la formation de caillots et de la structure par spectrométrie et microscopie électronique (MEB). Bêta-amyloïdes, qui forme des agrégats amyloïdes neurotoxiques dans la maladie d’Alzheimer (ma), s’est avéré d’interagir avec le fibrinogène. Cette interaction Aβ-fibrinogène rend le caillot de fibrine structurellement anormale et résistant à la fibrinolyse. Induite par l’Aß anomalies de coagulation de la fibrine peuvent aussi contribuer aux aspects cérébro-vasculaires de la pathologie AD tels que microinfarcts, l’inflammation, ainsi que, angiopathie amyloïde (CAA). Étant donné le rôle potentiellement critique des déficits neurovasculaire dans la pathologie de la ma, développement de composés qui peuvent inhiber ou réduire l’interaction Aβ-fibrinogène a une valeur thérapeutique prometteuse. Méthodes in vitro par lequel fibrine la formation de caillots peut être facilement et systématiquement évaluée sont des outils potentiellement utiles pour développer des composés thérapeutiques. Présenté ici est un protocole optimisé pour in vitro génération du caillot de fibrine, ainsi que l’analyse de l’effet des inhibiteurs d’interaction Aβ et Aβ-fibrinogène. Le test de turbidité de caillot est rapide, hautement reproductible et peut être utilisé pour tester plusieurs conditions en même temps, ce qui permet la projection d’un grand nombre d’inhibiteurs d’Aβ-fibrinogène. Succès composés de ce dépistage peuvent être évaluées davantage pour leur capacité à améliorer Aβ-induit des anomalies structurelles de l’architecture de caillot de fibrine à l’aide de SEM L’efficacité de ces protocoles optimisés est démontrée ici en utilisant TDI-2760, un inhibiteur d’interaction Aβ-fibrinogène identifié récemment.

Introduction

Maladie d’Alzheimer (ma), une maladie neurodégénérative conduisant à un déclin cognitif chez les personnes âgées, majoritairement découle anormale bêta-amyloïde (Aß) expression, d’agrégation et dégagement ayant une déficience entraînant neurotoxicité1, 2. Malgré l’association bien caractérisée entre les agrégats de bêta-amyloïdes et AD3, les mécanismes précis qui sous-tendent la pathologie de la maladie ne sont pas bien compris4. Plus en plus évident suggère que les déficits neurovasculaires jouent un rôle dans la progression et la sévérité des AD5, comme Aβ interagit directement avec les composants de l’ appareil circulatoire6. Bêta-amyloïdes a une interaction de forte affinité avec le fibrinogène7,8, qui localise également aux dépôts de bêta-amyloïdes dans les patients de l’AD et les souris modèles9,10,11. Par ailleurs, l’interaction Aβ-fibrinogène induit la formation de caillot de fibrine anormale et structure, ainsi que la résistance à la fibrinolyse9,12. Une des possibilités thérapeutiques dans le traitement de la ma est atténuer les déficits circulatoires en inhibant l’interaction entre Aβ et fibrinogène13,14. Nous avons, par conséquent, identifié plusieurs petits composés inhibant l’interaction Aβ-fibrinogène à l’aide de criblage à haut débit et la chimie médicinale approches13,14. Pour tester l’efficacité des inhibiteurs de l’interaction Aβ-fibrinogène, nous avons optimisé les deux méthodes d’analyse de in vitro formation de caillots de fibrine : coagulation test de turbidité et scanning electron microscopy (SEM)14.

Test de turbidité de caillot est une méthode simple et rapide pour le suivi de formation de caillots de fibrine en utilisant la spectroscopie UV-visible. Tant que le caillot de fibrine, formes, lumière est plus en plus dispersés et la turbidité de la solution augmente. À l’inverse, lorsque Aβ est présent, la structure du caillot de fibrine est altérée et la turbidité du mélange est réduite (Figure 1). L’effet des composés inhibiteurs peut être évaluée pour le potentiel de restaurer caillot turbidité d’anomalies induite par l’Aß. Alors que le test de turbidité permet pour l’analyse rapide des conditions multiples, il fournit des informations limitées sur le caillot forme et la structure. SEM, dans lequel la topographie des objets solides est révélée par la sonde électronique, permettant l’analyse de l’architecture 3D du caillot15,16,17,18 et l’évaluation de la façon dont la présence de bêta-amyloïdes et composés inhibiteurs et/ou modifie cette structure9,14. Les deux spectrométrie et SEM sont des techniques de laboratoire classiques qui ont été utilisés à diverses fins, par exemple, spectrophotométrie est utilisée pour surveiller l’agrégation amyloïde19,20. De même, SEM est également utilisé pour analyser le caillot de fibrine formé à partir du plasma de l’Alzheimer, Parkinson et maladies thrombo-emboliques patients21,22,23. Les protocoles présentés ici sont optimisés pour l’évaluation de la formation de caillot de fibrine de façon reproductible et rapide.

Le protocole suivant fournit les instructions pour la préparation d’un in vitro -caillot de fibrine avec et sans Aβ. Il détaille également les méthodes pour analyser l’effet des bêta-amyloïdes sur la formation de caillots de fibrine et de la structure. L’efficacité de ces deux méthodes pour mesurer l’inhibition de l’interaction d’Aβ-fibrinogène est démontrée à l’aide de TDI-2760, un petit composé inhibiteur14. Ces méthodes, individuellement et ensemble, permettent une analyse rapide et simple de in vitro formation de caillots de fibrine.

Protocol

1. préparation du fibrinogène et Aβ42 pour l’analyse Préparer Aβ42 monomère de poudre lyophilisée Réchauffer Aβ42 poudre à température ambiante et de la rotation vers le bas à 1 500 g pendant 30 s. Ajouter 100 µL de hexafluoroisopropanol glacee (HFIP) par 0,5 mg de poudre de Aβ42 et incuber pendant 30 minutes sur la glace.ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez HFIP et effectuez toutes les opérations sous une hotte chimique. Préparer 20 µL d’extra…

Representative Results

Dans in vitro test (turbidité) de la coagulation, la thrombine enzyme clive fibrinogène, entraînant la formation de la fibrine réseau24. Cette formation de caillot de fibrine entraîne la diffusion de la lumière passant à travers la solution, ce qui entraîne une augmentation de la turbidité (Figure 1), plafonnement avant la fin de la période de lecture (Figure 2, vert). Lorsque le fibrino…

Discussion

Les méthodes décrites ici constituent un moyen reproductible et rapid d’évaluation de fibrine caillot formation in vitro. En outre, la simplicité du système rend l’interprétation de la façon dont Aβ affecte la formation de caillots de fibrine et la structure relativement simple. La dernière publication de ce laboratoire, il a été démontré que ces tests peuvent servir à tester les composés pour leur capacité à inhiber l’Aβ-fibrinogène interaction13,<sup …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Auteurs remercient Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso et Michael Foley de Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York pour la synthèse d’inhibiteurs d’interaction Aβ-fibrinogène et leurs précieuses suggestions. Auteurs remercient également les membres du laboratoire Strickland de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les NIH grant NS104386, Alzheimer Drug Discovery Foundation et fonds de développement thérapeutique Robertson pour H.A., NIH grant NS50537, la Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation et John A. Herrmann pour la S.S.

Materials

Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma EMD Millipore 341578 keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture
Beta-Amyloid (1-42), Human Anaspec AS-20276
Thrombin from human plasma Sigma-Aldrich T7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% Sigma-Aldrich 105228
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED Sigma-Aldrich D2438
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Tris Base Fischer Scientific BP152
HEPES Fischer Scientific BP310
NaCl Fischer Scientific S271
CaCl2 Fischer Scientific C70
Filter Syringe, 0.2µM, 25mm Pall 4612
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. Millipore SLVV033RS
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom Fischer Scientific 21377203
Spectramax Plus384 Molecular Devices 89212-396
Centrifuge, 5417R Eppendorf 5417R
Branson 200 Ultrasonic Cleaner Fischer Scientific 15-337-22
Lab Rotator Thermo Scientific 2314-1CEQ
Spare washers for cover slip holder Tousimis 8766-01
Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet Electron Microscopy Sciences (EMS) 70967-13
Sample holder for CPD (Cover slip holder) Tousimis 8766
Mount Holder Box, Pin Type Electron Microscopy Sciences (EMS) 76610
Round glass cover slides (12 mm) Hampton Research HR3-277
10% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences (EMS) 16120
Ethanol Decon Labs 11652
24 well plate Falcon 3047
Na Cacodylate Electron Microscopy Sciences (EMS) 11652
SEM Stubs, Tapered end pin. Electron Microscopy Sciences (EMS) 75192
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD Ted Pella 16084-1
Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target Tousimis
Denton Desk IV Coater Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM Carl Zeiss
Smart SEM Software Carl Zeiss

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Singh, P. K., Berk-Rauch, H. E., Soplop, N., Uryu, K., Strickland, S., Ahn, H. J. Analysis of β-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58475, doi:10.3791/58475 (2018).

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