Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

A capacidade de um vírus de forma produtiva replicar em um host específico em parte rege-se pela disponibilidade de fatores de célula do hospedeiro que suportam entrada viral e replicação¹. A gama de vírus-host também pode ser ditada pela capacidade de um vírus para contador celular antiviral as defesas que caso contrário iria impedir a replicação viral^2,3. É o resultado dessas interações vírus-hospedeiro complexo que, finalmente, decidir se um vírus serão capaz de completar o seu ciclo de vida em um host específico. Dadas as consequências potencialmente patogénicas para o host se segue de replicação viral, é fundamental para desenvolver estratégias experimentais para promover nossa compreensão das interações vírus-hospedeiro chave que pode desequilibrar a balança entre abortivo e produtivo infecções. Elucidar as características moleculares da interação vírus-hospedeiro será fundamental para o desenvolvimento de novas e alternativas estratégias terapêuticas antivirais.

Com o advento do RNA de interferência (RNAi)^4,5 e as ferramentas de edição do genoma (EG., CRISPR-Cas9, zinco dedo nucleases, TALENs)^6,7, tornou-se viável experimentalmente para alterar a expressão de fatores celulares em todo o genoma escalas e explorar o impacto dessas alterações na replicação do vírus. Com efeito, foram realizadas numerosos RNAi e telas do genoma-edição-baseado em tipos de células do hospedeiro de invertebrados e vertebrados que têm revelado novas facetas do vírus-anfitrião interações^{8,9,10, 11 , 12}. essas telas geralmente empregam vírus codificação repórteres, como luciferase de vaga-lume (LUC) ou proteínas fluorescentes (EG., GFP, DsRed), que fornecem um meio conveniente de avaliar quantitativamente a expressão de gene viral como uma leitura para a replicação viral^9,12. Esta estratégia permite que os pesquisadores identificar os fatores do hospedeiro que ou promovem ou antagonizar a replicação viral, como evidenciado pela aumenta ou diminui, respectivamente, em repórter viral sinaliza^9,12. No entanto, na maioria dos casos, estas telas foram realizadas usando vírus que são bem adaptados para o tipo de célula do hospedeiro em que eles estão sendo estudados. Enquanto esta estratégia pode ser importante para a compreensão coevolutionary relações entre patógenos virais e seus hospedeiros naturais, isso levanta preocupações fundamentais em relação a seu uso em descobrir fatores antiviral do hospedeiro. Nestes casos, um aperfeiçoamento no repórter vírus sinal em cima de RNAi “knockdown” está sendo procurado, ou a inativação de um fator celular que normalmente impede a replicação viral. Primeiro, se um vírus já é capaz de robustamente replicar na célula hospedeira, sendo examinada sob condições de controlo, a gama dinâmica da tela (ou seja, a capacidade de distinguir entre o fundo e sinais de maior repórter viral) pode ser limitada. Em segundo lugar, esta questão é ainda mais agravada pelas situações em que o vírus está bem adaptada para a célula hospedeira e eficaz na luta contra vias de defesa de anfitrião que estão a ser alvo na tela.

Devido as preocupações acima de interação vírus-hospedeiro tradicionais métodos de rastreio, desenvolvemos um novo paradigma para o estudo de interações vírus-hospedeiro que exploram infecções naturalmente abortivo arbovírus em células de insetos lepidópteros. Esta estratégia deriva de uma observação que o arbovírus humana estudada, VSV, sofre uma infecção abortiva em células derivadas de gypsy moth (L. dispar)¹³. VSV é naturalmente transmitida por insectos frequentes (ou seja, areia moscas) para hospedeiros mamíferos e tem sido demonstrado experimentalmente para infectar uma grande variedade de invertebrados e vertebrados hospedeiros em celulares cultura e na vivo¹⁴. 11-kb sentido negativo single-stranded RNA genoma de VSV codifica cinco mRNAs subgenomic que cada um foram traduzidos para as proteínas que compõem o vírion envelopada. No entanto, sistemas de genética reversos VSV permitiram a criação de replicação competente cepas codificação LUC ou proteínas fluorescentes, além de cinco natural VSV gene produtos^15,16,17. Porque estas proteínas repórter não são incorporadas o vírion VSV, eles fornecem uma leitura conveniente para expressão de gene VSV que ocorre após a entrada. Usando cepas VSV codificação GFP ou LUC, anteriormente mostramos que a expressão gênica VSV é severamente restringido aquando da entrada das células LD652 e que títulos VSV não aumentam por infecção pós de 72 horas (hpi). Em contraste, a co-infecção de LD652 células com VSV e o poxvírus mamíferos, vírus vaccinia (VACV), conduz a aumentos logarítmicos na expressão gênica VSV e títulos por este ponto de tempo. VACV sofre a expressão de gene inicial, replicação do DNA e tarde expressão gênica em infecções de células LD652, mas o ciclo de replicação VACV é abortivo, finalmente, devido à incompleta do virion morfogênese¹⁸. O genoma de DNA ~ 192 kb grande de VACV codifica proteínas > 200, muitos dos quais exibem propriedades immunomodulatory que promovem a replicação viral através da supressão de respostas imunes do anfitrião¹⁹. Portanto, formulamos a hipótese que o “resgate” de replicação VSV nas células LD652 por co-infecção VACV foi provavelmente mediado por VACV imunomoduladores que inibiu dispar L. respostas normalmente restringir a replicação de VSV. Em apoio isso, o tratamento de células LD652 com inibidor anfitrião RNA polimerase II actinomicina D também resgata a replicação do VSV nas células LD652, indicando que as respostas do hospedeiro dependente de transcrição bloqueiam VSV replicação pós-entrada¹³.

As observações acima sugerem que a natureza naturalmente restritiva de LD652 células à infecção VSV pode fornecer um fundo relativamente baixo, quando o rastreio para as condições que aumentam os sinais codificados VSV repórter (ou seja, aqueles que inibem o anfitrião defesas antivirais). Aqui, nós fornecemos os métodos para usando fluorescência ou ensaios baseados em LUC a tela para as condições que aliviar a restrição de VSV nas células lepidópteros. Primeiro, mostramos como estes ensaios podem ser usados para identificar fatores de imunomoduladores virally codificado que quebre a restrição de VSV também experiências de co-infecção ou por meio de expressão ectópica de fatores virais de candidato. Como exemplo, ilustramos como usamos estas técnicas de triagem para identificar proteínas codificadas poxvírus de A51R como uma nova família de fatores de imunomoduladores que resgatar a replicação de VSV, na ausência de outros fatores de poxvírus¹³. Em segundo lugar, ilustramos como RNAi triagem em infecções de célula restritivas VSV-LD652 pode ser usado para identificar diretamente fatores do hospedeiro eucarióticas envolvidos em arbovírus restrição¹³.