En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.
Summary
Salmonella spp. /Shigella spp. er vanlige patogener til diaré. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming plattform for screening av Salmonella spp. /Shigella spp. bruker sanntid PCR kombinert med guidede kultur.
Abstract
Fecal-muntlige overføring av akutt gastroenteritt skjer fra tid til annen, spesielt når folk som behandlet mat og vann er smittet av Salmonella spp./Shigella spp. Metoden gullstandarden for påvisning av Salmonella spp./Shigella spp. er direkte kultur, men dette er arbeidskrevende og tidkrevende. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming plattform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, ved hjelp av sanntids polymerasekjedereaksjons (PCR) kombinert med guidede kultur. Det er to store stadier: sanntid PCR og guidede kultur. For det første trinnet (sanntid PCR) vi forklare hvert trinn av metoden: prøve samling, pre berikelse, DNA utvinning og sanntid PCR. Hvis sanntid PCR resultatet er positiv, så den andre fasen (guidet kultur) utføres: selektiv kultur, biokjemisk identifisering og serologisk karakterisering. Vi illustrerer også representant resultatene fra den. Protokoll beskrevet her kan være en verdifull plattform for rask, bestemte, følsom og høy gjennomstrømming screening av Salmonella spp. /Shigella spp.
Introduction
Diaré er fortsatt en vanlig sunnhet problem med en høy forekomst rate globalt1,2. Om dødeligheten er relativt lav, noen pasienter viser ulike symptomer i uker (for eksempel løs og vannaktig avføring, et haster å gå på do), som gjør sosioøkonomiske innvirkning svært høy3,4. Mer alvorlig, noen pasienter kan selv utvikle irritabel tarm hvis venstre ubehandlet5. Det finnes ulike typer bakterier, virus og parasitter som kan forårsake diaré6. Salmonella spp. /Shigella spp. er blant de vanligste bakteriene for overføring av akutt gastroenteritt,7,,8,,9,,10,,11. Derfor mange fylker har utstedt lover eller forskrifter for vanlige Salmonella spp. /Shigella spp. screening blant folk som skulle håndtere mat og vann. For eksempel den kinesiske regjeringen har utstedt lover for obligatoriske Salmonella spp. /Shigella spp. screening en gang i året.
Metoden gullstandarden for Salmonella spp. /Shigella spp. gjenkjenning er bakterier kultur. Gjennom bakterier kultur og påfølgende biokjemisk identifisering og serologisk karakterisering, kan vi identifisere arter av bakterier, som kan lette sykdom utbrudd ledelse og antimikrobielle profilering hjelp behandlingen av pasienter 12. det kan også hjelpe spore smittekilden under Salmonella spp. /Shigella spp. utbruddet13. Denne metoden er imidlertid arbeidskrevende (krever manuell drift) og tidkrevende (ta flere dager), spesielt for testing av store antall prøver7. Videre levedyktig men ikke-culturable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kan finnes i noen avføringsprøver14. I lys av disse ulempene, mange laboratorier har forsøkt å utvikle nye teknikker for påvisning av Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. alle disse metodene bruk kjernefysiske syre forsterkning testen (NAAT), blant annet polymerasekjedereaksjons (PCR) er den vanligste. Ettall større begrensningen av metodene NAAT basert er at døde bakterier, selv bakteriell rusk som inneholder ufullstendig genomisk DNA, kan positive resultater26, som kan i stor grad påvirke den nøyaktig diagnosen av sykdommen. Blanco et al. viste at molekylær analysen er svært følsom, ikke bare levedyktig Salmonella i kulturer, men også delvis genomer og død eller unviable bakterier fra siste infeksjoner eller forurensning26. Derfor bør ny teknologi utvikles.
Her beskrev vi en roman metode som kombinerer NAAT basert metode og dyrking. Som vist i figur 1, denne nye metoden gjelder sanntid PCR screening først og deretter positiv eksemplene sendes for bakterier kultur og identifikasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siden Salmonella spp. /Shigella spp. er ofte forbundet med matforgiftning og fecal-muntlige overføring av akutt gastroenteritt28,29 og rutinemessig metoden er arbeidskrevende eller tidkrevende 7, beskriver vi en høy gjennomstrømming plattform for Salmonella spp. /Shigella spp. screening, bruker sanntid PCR kombinert med guidede kultur.
Det er flere trinn som trenger å maks…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av vitenskapen og teknologi Program av Zhuhai, Kina (gi nummer 20171009E030064), vitenskap og teknologi programmet i Guangdong, Kina (gi nummer 2015A020211004) og vitenskap og teknologi Program av General Administration Quality tilsyn, inspeksjon og karantene av Folkerepublikken Kina (nummer grant-2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
Riferimenti
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
