Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.
Summary
Salmonella spp.Shigella spp. являются общие патогенов, приписываемых понос. Здесь мы описываем платформу высокой пропускной способностью для проверки Salmonella spp. /Shigella spp., с помощью ПЦР в реальном времени в сочетании с гидом культуры.
Abstract
Фекально оральным механизмом передачи острый гастроэнтерит возникает время от времени, особенно, когда люди, которые занимаются продовольствия и воды заражены Salmonella spp./Shigella spp. Золотой стандарт метод для обнаружения Salmonella spp./Shigella spp. прямым культура, но это является трудоемким и длительным. Здесь мы описываем платформу высокой пропускной способностью для Salmonella spp./Shigella spp. отбора, с использованием реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) в сочетании с гидом культуры. Существует два основных этапа: ПЦР в реальном времени и руководствоваться культуры. Для первого этапа (ПЦР в реальном времени), мы объяснять каждый шаг метода: образец коллекции и предварительного обогащения, экстракции ДНК, ПЦР в реальном времени. Если результаты ПЦР в реальном времени является положительным, то проводится второй этап (управляемое культура): селективный культуры, биохимической идентификации и серологических характеристик. Мы также иллюстрируют представитель результаты, полученные от него. Протокол, описанные здесь будет ценной платформой для быстрого, конкретные, чувствительной и высок объём проверки Salmonella spp. /Shigella spp.
Introduction
Диарея является до сих пор общей проблемой здравоохранения с высокой заболеваемостью глобально ставка1,2. Хотя смертность является относительно низким, у некоторых больных показывают различные симптомы недель (например, сыпучих и водянистый стул, срочности, чтобы перейти к ванной комнате), которые делают социально-экономического воздействия очень высокий3,4. Более серьезно некоторые пациенты даже может развиться синдром раздраженного кишечника, если оставить неочищенные5. Существуют различные виды бактерий, вирусов и паразитов, которые могут вызвать понос6. Salmonella spp. /Shigella spp. относятся к числу наиболее распространенных бактерий для передачи острый гастроэнтерит7,8,9,10,11. Таким образом, многие графства изданы законы или правила для регулярных Salmonella spp. /Shigella spp. скрининг среди людей, которые будут обрабатывать пищу и воду. Например, правительство Китая издали законы для обязательного Salmonella spp. /Shigella spp. Скрининг один раз в год.
Метод золотого стандарта для Salmonella spp. / культуры бактерийShigella spp. обнаружения. Через культуры бактерий и последовательных биохимической идентификации и серологических характеристики мы можем определить виды бактерий, которые могли бы способствовать управлению вспышки болезни и противомикробные профилирования для оказания помощи в лечении больных 12. Она также может помочь отследить источник инфекции во время Salmonella spp. /Shigella spp. вспышки13. Однако этот метод является трудоемким (требующие ручной работы) и времени (принимая несколько дней), особенно для тестирования большого числа образцов7. Кроме того жизнеспособных, но не culturable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.может существовать в некоторых образцах стула14. С учетом этих недостатков, многие лаборатории пытались разрабатывать новые методы для обнаружения Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. все эти методы используют ядерные кислоты амплификации тест (NAAT), среди которых полимеразной цепной реакции (ПЦР) является наиболее распространенным. Одним из основных ограничений этих NAAT на основе методов является, что Мертвые бактерии, даже бактериальных мусора содержащих неполные геномной ДНК, могут показать положительные результаты26, который может во многом повлиять точный диагноз заболевания. Бланко et al. показали, что молекулярные пробирного очень чувствительна, не только жизнеспособные сальмонеллы в культурах, но и для частичного геномов и мертвых или неэффективных бактерий от прошлых инфекции или загрязнение26. Таким образом следует разработать новые технологии.
Здесь мы описали новый метод сочетает NAAT на основе метода и культивирования. Как показано на рисунке 1, этот новый метод применяется в реальном масштабе времени PCR скрининг первого и затем положительные образцы отправляются для культуры бактерий и идентификации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Начиная с Salmonella spp. /Shigella spp. часто связаны с пищевых отравлений и фекально оральным механизмом передачи острый гастроэнтерит28,29 и обычной метод трудоемкий или времени 7, мы описываем платформу высокой пропускной способностью для S…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана науки и технологии программы Чжухай, Китай (Грант номер 20171009E030064), науки и технологии программы Гуандун, Китай (Грант номер 2015A020211004) и науки и технологии программы общей администрации надзору за качеством, инспекции и карантину Китайской Народной Республики (Грант номер 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
Riferimenti
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
