Summary

Высок объём Cre-Lox активации вирусного мембраны Fusion Assay для выявления ингибиторы синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1

Published: August 14, 2018
doi:

Summary

Мы описываем на основе ячеек пробирного представить доклад о ВИЧ-1 Сплавливание через выражение зеленого флуоресцентного белка обнаружению потока цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Он может использоваться для тестирования ингибиторы вирусный вход (специально на шаге фьюжн) в системах свободных клеток и клеток к инфекции.

Abstract

Этот assay предназначен для специально доклад о ВИЧ-1 Сплавливание через выражение зеленого флуоресцентного белка (ГФП) обнаружению потока цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Репортер вирусов ВИЧ-1 (ВИЧ-1 кляп МСВЗ) генерируется, вставив рекомбиназа КРР в геном ВИЧ-1 между матрицей и капсульных белков polyprotein кляп. Это результаты в упаковке рекомбиназа КРР в частицы вируса, который затем выпущен в целевой ячейке строки, стабильно выражая Cre рекомбиназа активированный красный флуоресцентный белок (RFP) GFP переключатель кассету. В состоянии базальной эта кассета выражает только ППП. После доставки рекомбиназа КРР в целевую ячейку ППП, обрамленная loxP сайтов, акцизы, результате экспрессия гена GFP. Этот assay может использоваться для проверки любых ингибиторов вирусный вход (специально на шаге фьюжн) в системах свободных клеток и клеток к инфекции и был использован для идентификации класса антагонистов рецепторов purinergic как Роман ингибиторы синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1.

Introduction

Потребность в новой антиретровирусной терапии побудило развитие экранов высокой пропускной способностью для ингибиторы ВИЧ-1 записи. Assay репортера кляп МСВЗ разработана для выявления ингибиторы вирусные записи на шаге фьюжн в системе к ячейке инфекции, специально измеряя вирусный мембраны сплавливание с принимающей клеточной мембраны1. Assay была разработана экран Роман ингибиторов, которые действовали непосредственно на ранних стадиях ВИЧ-1 инфекции до точки синтеза вирусных мембраны. Один вызов для измерительных ячеек инфекции является, что первоначальный посевным материалом содержит инфицированных доноров клетки и клетки ininfected цели, поэтому измерение новой инфекции трудно различать из ячеек ввода. Идеальная система будет включать маркер гетерологичных генов, который может быть вызвана начало целевой ячейки инфекции и не присутствует в клетке доноров. Популярных вирусных содержимое смешивания пробы, основанные на слияние вирусного белка фермента, Блам-Vpr, может быть эффективным, но имеет ограничения для высокой пропускной способности, ячейке скрининг2. Этот assay включает бета лактамаз (Блам) Репортер ген, который сливается с ВИЧ-1 Vpr, упаковывается в вирионы и доставлены в клетки-мишени после вирусных мембраны фьюжн. Субстрат CCF2-AM загружается в цитоплазме клеток-мишеней и подвергается флуоресценции сдвига после расщепления. CCF2-ам субстрата является дорогостоящим и может быть непомерно высокой для экранов высокой пропускной способности. Для того, чтобы отличить доноров и целевые клетки, это необходимо для краска ярлык целевых групп населения. Наконец протокол требует несколько мыть и инкубации шагов, которые могут быть обременительными и дорогостоящими при тестировании большого числа соединений.

Кляп МСВЗ assay был разработан как решение этих вопросов, для разработки высокопроизводительного скрининга для ингибиторы синтеза в ячейке для передачи. Эта система не требует субстрат для загрузки в клетки. Может также использоваться для ячейки свободного исследования и адаптированы для других исследований вирусных фьюжн с помощью псевдо-типизированных частицы вируса ВИЧ-1 кляп МСВЗ. ВИЧ Env опосредованной ячеек фьюжн анализов можно измерить вирус Env белка опосредованной клеток фьюжн, однако они не использовать фактические вирусных частиц как assay кляп МСВЗ ВИЧ-1 и3,,45. Этот assay может читать с потоком цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Она успешно используется для экрана FDA библиотеки, а также небольшая библиотека purinergic ингибиторы1,6. Другие исследователи выявили также purinergic ингибиторов в fusion ВИЧ-1, используя assay адаптирована и оптимизирована высок объём фьюжн, сообщает передачи вируса инкапсулированное бета лактамаз в цитоплазме7,8 .

Кляп МСВЗ вирус был разработан с аналогичный подход к кляп iGFP вируса, вставляя Cre рекомбиназа между матрицей и капсид, обрамленная сайты протеаз ВИЧ-19. Cre фермента производится как прекурсор вставлены в пределах polyprotein кляп, созревает активированы протеаз ВИЧ-1 в рамках нарождающегося вирус частиц. Cre доставки зависит, таким образом, доставки содержимого частиц активированного протеазы ВИЧ-1 в целевой ячейке через процесс синтеза вирусных мембраны. Здесь предоставляются две версии протокола. Первый использует населения инфицированы ВИЧ-1 заразить клетки-мишени, учиться непосредственно в ячейке передачи ВИЧ. Вторая версия использует ячейки свободный вирус для изучения клеток бесплатно вирусной инфекции. К ячейке передачи пробирного занимает 7 дней со дня талой клетки, или 5 дней, если клетки уже растаяло и пассированные. Assay клетки бесплатно инфекции могут выполняться в 5 дней, если клетки нужно быть разморожен и 3 дня, если клетки оттаяла и пассированной. Инструкции приведены также для генерации RG (красный зеленый) целевой ячейки линии в нужной ячейки типа (если не используется ранее существовавшие RG целевой ячейки линии) с помощью плазмида, созданные Clevers Lab10. Рекомендуется, чтобы соответствующие биобезопасности меры предосторожности принимаются с вирус и вирус выражая клетки в этот assay. Мы проводим инфекционных часть этот assay в учреждении культуры ткани BSL2 +. После того, как клетки являются фиксированными, они могут быть проанализированы в стандартный поток цитометрии и микроскопии.

Здесь мы описываем приложения этот assay экран для Роман соединений, которые подавляют синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1 (рис. 1). Purinergic рецепторы являются про воспалительных медиаторов. Наша лаборатория продемонстрировал, что не селективных ингибиторов purinergic рецепторов действовать как ингибиторы ВИЧ-1 вирусный мембраны фьюжн6. Мы сообщаем, что использование этот assay в высокой пропускной способности можно определить Роман ингибиторов фьюжн вирусный мембраны ВИЧ-1. Мы демонстрируем, что ингибитор purinergic класса рецепторов представляет новый класс ингибиторов синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1.

Protocol

1. поколение целевой клеточных линий Примечание: Этот шаг не является обязательным; При использовании существующей линии RG целевой ячейки, начните с шага 2. Cotransfect 70% вырожденная 10 см пластины 293T клетки11 [в 10 мл среды (DMEM) Дульбекко изменение орла с 10% плода …

Representative Results

Неинфицированных клеток Jurkat RG демонстрируют низкий уровень фонового сигнала GFP (0,3%) с очень сильный сигнал ППП (рисунок 2A, неинфицированным столбец). Инфекции с кляп МСВЗ приводит к увеличению в GFP сигнала (24,9%), а наличие ингибитора фьюжн ВИЧ-1 AMD3100 (20 мкм) ?…

Discussion

Кляп МСВЗ assay оказался весьма полезным для скрининга наркотиков кандидатов, которые могут препятствовать сплавливание шага вирусной репликации. При выполнении этот assay, наиболее важные шаги, чтобы получить хороший сигнал похожи на большинство вирусных инфекций анализов. Первым важным…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантов NIH/NIAID AI112423 и NIH/NIGMS GM113885 для Чэнь K. Бенджамин и низ/NIAID K08-AI120806 чтобы Талия H. Шварц. Мы хотели бы поблагодарить Icahn школы медицины в Маунт Синай Дин потока цитометрии ядро.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma Aldrich D5546 Media for 293 Cells
RPMI-1640 Sigma Aldrich R0883 Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin Gibco 16140-071 Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.03 Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution GE Healthcare Life sciences SV30010 Penn/Strep used in both media
T75 Flasks Corning 3073 Used for Culture of Jurkat Cells
10cm Tissue Culture Plates Corning 430167 Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated) Corning 3595 Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent Signagen SL100688 Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537-100ML Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease GE Healthcare Life sciences SH30042.01 For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus GE Healthcare Life sciences 17144002 For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes Fisher Brand 13-678-11E For all tissue culture
Pipettor Tips Denville Scientific P3020-CPS For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 micron) Millipore SLHA033 For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes BD Diagnostics 309656 For filtration of virus
Amaxa Nucleofector Lonza 2b for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood Various models Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE Addgene 32702 Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1 Novus Bio NBP2-29542 Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre Benjamin Chen Lab Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).

Riferimenti

  1. Esposito, A. M., et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology. 490, 6-16 (2016).
  2. Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).
  3. Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay. Cytometry. 47, 100-106 (2002).
  4. Sakamoto, T., et al. Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene. Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).
  5. Herschhorn, A., et al. An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors. PLoS One. 6, e26731 (2011).
  6. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).
  7. Marin, M., et al. High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).
  8. Giroud, C., et al. Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).
  9. Hubner, W., et al. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).
  10. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, 81-83 (2011).
  11. Pear, W. S., et al. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).
  12. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).
  13. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium Phosphate Transfection. Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).

Play Video

Citazione di questo articolo
Esposito, A. M., Soare, A. Y., Patel, F., Satija, N., Chen, B. K., Swartz, T. H. A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion. J. Vis. Exp. (138), e58074, doi:10.3791/58074 (2018).

View Video