Intravenös och Intra-fostervatten In Utero Transplantation i murina modellen
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att utföra en i livmodern transplantation (IUT) genom intravenös och intra-fostervatten vägar av injektion i murina modellen. Detta protokoll kan användas för att införa celler, virala vektorer och andra ämnen i den unika immun-tolerant fostrets miljön.
Abstract
In utero transplantation (IUT) är en unik och mångsidig läge av terapi som kan användas för att införa stamceller, virala vektorer eller andra ämnen i början av dräktigheten. Logiken bakom IUT för terapeutiska ändamål är baserad på den lilla storleken på fostret, den fetala immunologisk omognad, tillgänglighet och proliferativ naturen av de fetala stamceller eller stamceller cellerna och potential att behandla en sjukdom eller symtomen före födseln. Dra nytta av dessa normala utvecklingsmässiga egenskaper av fostret, leverans av hematopoetiska stamceller (HSC) via en IUT har potential att behandla medfödda hematologiska störningar såsom sicklecellsjukdom, utan det krävs myeloablativ eller immunsuppressiva luftkonditionering krävs för postnatal HSC transplantationer. Likaså kan tillgängligheten av stamceller i flera organ under utveckling potentiellt för en mer effektiv inriktning av stammen/stamceller efter en IUT av virala vektorer för genterapi eller gen editering. Dessutom kan IUT användas att studera normala utvecklingsprocesser inklusive, men inte begränsat till, utveckling av immunologisk tolerans. Murina modellen ger en värdefull och prisvärd möjlighet att förstå möjligheter och begränsningar av IUT före prekliniska studier på stora djur och en eventuell klinisk tillämpning. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra en IUT i murina fostret genom intravenös och intra-fostervatten vägar. Detta protokoll har använts framgångsrikt att klarlägga nödvändiga villkor och mekanismer bakom Utero hematopoetisk stamcellstransplantation, toleransutveckling och Utero genterapi.
Introduction
Senaste framstegen inom prenatal screening och diagnos har visat att möjligheten att behandla fostret för ett antal medfödda störningar som inte har adekvat postnatal behandlingsalternativ och leda till betydande sjuklighet och dödlighet. I synnerhet har i livmodern hematopoetisk stamcellstransplantation (IUHCT) och gene therapy/gen editering potential att dra nytta av normala utvecklingsmässiga egenskaper av fostret att behandla medfödda hematologiska, immun och genetiska sjukdomar mer effektivt än postnatal HSC transplantation och gene therapy/gen editering kan göra1,2. Specifikt på grund av den lilla storleken på fostret, kan givare cellen eller virala vektorn dos maximeras per vikt av mottagaren. Dessutom tillåter den immunologiska omognad av fostret givare Förenta injiceras utan myeloablativ och immunsuppressiva luftkonditionering som krävs i postnatal transplantation protokoll. Likaså kan virala vektorer bära en terapeutisk transgenens eller genomet redigering teknik injiceras utan ett begränsande immunsvar mot antingen transgenens produkt eller virala vektorn. Slutligen, tillgänglighet och proliferativ naturen av fetala stamceller/stamceller ger möjlighet att en effektivare transduktion av målet stamceller, liksom vissa lägen av genomet redigering (homologi-regisserad reparation) som kräver Cykling celler förekommer effektivt. Murina modellen fungerar som ett insiktsfulla och prisvärt sätt att ta itu med viktiga frågor i stamcellsbiologi och immunologi före experimentera i prekliniska stora djurmodeller och, som sådan, har fungerat som den primära modellen där IUHCT och i livmodern genterapi har varit utforskade1,2,3.
Även om många variabler har en viktig roll i framgången för IUHCT och i utero gen terapi/gen editering i murina och stora djurmodeller, är en nyckelvariabel metoden för leverans av Förenta eller virala vektorn. Leverans av stora doser av givare Förenta med en första-passage-effekten uppstår i fetala levern, hematopoetiska orgeln vid tidpunkten för IUHCT, har visat sig vara avgörande för att nå macrochimeric nivåer av engraftment mus och stora djurmodeller4 ,5. Detta var uppnås via en injektion av givare celler via den vitelline ven i musmodell och via en intra cardiac injektion i Hundarnas modellen. Sträckningen av injektion också spelar en grundläggande roll i inriktning stamceller av olika organ under utveckling. Exempelvis en intravenös injektion via den vitelline ven har visat sig effektivt transduce hjärtmuskelceller och hepatocyter efter en sen dräktighet injektion6,7. Alternativt kan en intra-fostervatten injektion av virala vektorer inriktningen av organ som utsätts fysiskt baserat på den fällbara/fosterutvecklingen vid tidpunkten för injektion8. Detta exemplifieras bäst av inriktningen av respiratoriskt epitel via en intra-fostervatten injektion sent i dräktigheten att dra nytta av normala foster ”andas” rörelser, som exponerar luftvägarna till virala vektorn i den fostervatten flytande9. Dessa två lägen av IUT, intravenös via den vitelline ven och intra-fostervatten, har legat till grund för flera tidigare och pågående experiment i vårt laboratorium. I detta protokoll beskriver vi i detalj metoderna för att utföra intravenös och intra-fostervatten IUT i murina modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In utero transplantation är en potentiell behandling för många medfödda sjukdomar som kan diagnostiseras tidigt i dräktigheten. Murina modellen för IUT tillåter forskare att undersöka fostrets miljön eller för att experimentera med olika terapier. Beroende på vad som injiceras och vad är riktade, kan intravenös eller intra-fostervatten i livmodern transplantation ge en tillförlitlig leverans av en injectant in i önskat utrymme.
När rikta specifika organ, är d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Riferimenti
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
