Intravenöse und Intra-Fruchtwasser In der Gebärmutter Transplantation in den Mausmodell
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für eine Transplantation in Utero (IUT) durch intravenöse und Intra-Fruchtwasser Routen der Injektion in das Mausmodell ausführen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, Zellen, virale Vektoren und anderen Stoffen in die einzigartige immun-toleranten fetalen Umgebung einzuführen.
Abstract
In der Gebärmutter Transplantation (IUT) ist eine einzigartige und vielseitige Art der Therapie, die verwendet werden, um Stammzellen, virale Vektoren oder anderen Substanzen früh in der Schwangerschaft einzuführen. Das Grundprinzip hinter IUT zu therapeutischen Zwecken basiert auf die geringe Größe des Fötus, der fetalen immunologische unreife, die Zugänglichkeit und proliferative Natur der fetalen Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen und das Potenzial zur Behandlung einer Krankheit oder dem Auftreten von Symptomen vor der Geburt. Unter Ausnutzung dieser normalen Entwicklungsstörungen Eigenschaften des Fötus, die Lieferung der Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) über ein IUT hat das Potenzial zur Behandlung von angeborener hämatologischen Erkrankungen wie Sichelzellenanämie, ohne die erforderliche Bolusinjektion oder immunsuppressive Klimaanlage erforderlich für postnatale HSC-Transplantationen. In ähnlicher Weise erlaubt die Zugänglichkeit von Vorläuferzellen in mehreren Organen während der Entwicklung potenziell für eine effizientere Ausrichtung der Stamm/Progenitorzellen nach einem IUT von viralen Vektoren für die Gentherapie oder Genom-Bearbeitung. Darüber hinaus kann IUT zur Untersuchung von normalen Entwicklungsprozesse einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Entwicklung der immunologischen Toleranz. Das Mausmodell bietet eine wertvolle und erschwingliche Mittel zum Verständnis der Möglichkeiten und Grenzen der IUT vor großen Tieren vorklinik und eine mögliche klinische Anwendung. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Durchführung eines IUT in murinen Fötus durch intravenöse und Intra-Fruchtwasser Routen. Dieses Protokoll wird erfolgreich eingesetzt, um die notwendigen Bedingungen und Mechanismen hinter in Utero hämatopoetische Stammzell-Transplantation und Toleranzinduktion in Utero Gentherapie zu erhellen.
Introduction
Jüngste Fortschritte in pränatale Screening und Diagnose haben die Möglichkeit der Behandlung von den Fötus für eine Reihe von angeborenen Störungen, die nicht über ausreichende postnatale Behandlungsmöglichkeiten und erheblicher Morbidität und Mortalität zur Folge Licht gebracht. Insbesondere haben in Utero Transplantation hämatopoetischer Stammzellen (IUHCT) und Gen-Therapie/Genom-Bearbeitung das Potenzial, normale Entwicklungsstörungen Eigenschaften des Fötus zur Behandlung von angeborenen hämatologischen, Immun- und genetischen nutzen effizienter als postnatale HSC-Transplantation und Gen-Therapie/Genom-Bearbeitung1,2vermag Störungen. Insbesondere kann aufgrund der geringen Größe des Fötus, die Spender Zelle oder viralen Vektoren Dosis pro das Gewicht des Empfängers maximiert werden. Darüber hinaus ermöglicht die immunologische Unreife des Fötus, dass Spender HSCs injiziert werden, ohne die Bolusinjektion und immunsuppressive Konditionierung, die in den Protokollen der postnatalen Transplantation erforderlich ist. In ähnlicher Weise können virale Vektoren mit einem therapeutischen Transgen oder Genom-Bearbeitungs-Technologie ohne eine einschränkende Immunantwort auf das Transgen-Produkt oder die viralen Vektoren injiziert werden. Schließlich leisten die Zugänglichkeit und proliferative Natur des fetalen Stammzellen/Vorläuferzellen die Möglichkeit, eine effizientere Transduktion Ziel Vorläuferzellen sowie bestimmte Modi des Genoms bearbeiten (unter der Regie von Homologie Reparatur) erfordern Radfahren Zellen effizient auftreten. Das Mausmodell dient als eine aufschlussreiche und erschwingliche Mittel auf wichtige Fragen in Stammzellbiologie und Immunologie vor in präklinischen große Tiermodellen zu experimentieren und als solche diente als das primäre Modell in der IUHCT und in der Gebärmutter Gen-Therapie wurden erkundet1,2,3.
Obwohl viele Variablen eine wichtige Rolle für den Erfolg der IUHCT und in Utero Gen Therapie/Genom-Bearbeitung in murinen und große Tiermodellen spielen, ist eine wichtige Variable die Methode der Lieferung der HSCs oder viralen Vektoren. Die Lieferung von hohen Dosen von Hsz Spender mit einem First-Pass-Effekt in der fetalen Leber, das blutbildende Organ zum Zeitpunkt der IUHCT auftretenden nachweislich maßgeblich bei der Erreichung Macrochimeric Ebenen des Engraftment in Maus und große Tiermodellen4 ,5. Dies wurde erreicht durch eine Injektion von Spender Zellen über die dotterhäutchen Vene im Mausmodell und über eine Intra kardiale Injektion im eckzahn Modell. Die Route der Einspritzung spielt auch eine wesentliche Rolle bei der Ausrichtung der Vorläuferzellen der verschiedenen Organe während der Entwicklung. Zum Beispiel eine intravenöse Injektion über die dotterhäutchen Vene nachweislich effizient transduzieren Kardiomyozyten und Hepatozyten nach einem späten Schwangerschaft Injektion6,7. Alternativ kann eine Intra-Fruchtwasser Injektion von viralen Vektoren, die Ausrichtung der Organe, die physisch ausgesetzt sind, basierend auf der Faltung/Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Injektion8. Dies ist am besten veranschaulicht durch die Ausrichtung der respiratorischen Epithel über einer Intra-Fruchtwasser Injektion spät in der Schwangerschaft normal “atmen” Kindsbewegungen, nutzen die Macht der Atemwege zu den viralen Vektoren in der Fruchtblase Fluid-9. Diese beiden Modi der IUT intravenös über die Vene dotterhäutchen und Intra-Fruchtwasser, wurden die Grundlage für mehrere abgeschlossene und laufende Experimente in unserem Labor. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methoden zum Ausführen von intravenösen und Intra-Fruchtwasser IUT in das Mausmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Gebärmutter Transplantation ist eine mögliche Therapie für viele angeborene Erkrankungen, die früh in der Schwangerschaft diagnostiziert werden können. Mausmodell für IUT erlaubt Forschern, die fetale Umgebung zu erkunden oder zum Experimentieren mit verschiedenen Therapien. Je nachdem was eingespritzt wird und was richtet kann intravenöse oder Intra-Fruchtwasser in der Gebärmutter Transplantation eine zuverlässige Lieferung von einer eindüsungsluft in den gewünschten Raum bieten.
…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Riferimenti
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