Caenorhabditis Peneira: Um instrumento de baixa tecnologia e metodologia para classificação de pequenos organismos multicelulares

O verme nematoide, Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo premier. Além da natureza simples e controlada do seu cultivo em laboratório, todo o seu genoma é sequenciado¹ e o destino do desenvolvimento de cada célula é conhecido². Devido a estas características, c. elegans é um organismo modelo amplamente usado para estudos genéticos. No entanto, juntamente com estas características benéficas vem alguns desafios para os pesquisadores. Devido ao seu tempo de geração rápida, as populações de c. elegans rapidamente podem ficar sem comida e/ou se misturam as populações com várias gerações e estádios de desenvolvimento presentes ao mesmo tempo. Assim, experimentos realizados na mídia de crescimento sólido de nematoides (NGM) exigem pesquisadores mover fisicamente os animais para placas frescas antes da fonte de alimento bacteriana esgota e desenvolvem novas larvas. Isto pode ser tedioso como uma transferência frequente dos animais é necessária para evitar as populações experimentais de tornar-se misturado com gerações de prole. Ainda, alguns experimentos requerem ambos grande número de animais e de pontos de tempo prolongado (por exemplo, extração de DNA ou RNA na idade adulta). Este compostos os desafios com precisão, mantendo uma população sincronizada e transferir um grande número de animais.

Métodos atuais de transferência de c. elegans cultivadas em NGM estão escolhendo ou lavar os animais de placa para placa; quimicamente, tratando os animais (por exemplo, com o DNA replicação inibidor fluorodeoxyuridine ou FUDR); ou usando citometria de fluxo para classificar os animais em placas multi bem. Colheita envolve o uso de uma ferramenta de mão, feito com um arame fino de platina ou um cílio, para transferir manualmente o indivíduo ou vários animais^3,4. Esse método é preciso, mas requer habilidade e tempo e é uma limitação de estudos envolvendo um grande número de animais. Escolher o maio também ser fisicamente prejudiciais e estressante para os animais potencialmente sujeitando indivíduos quantias antinatural e inconsistente de perturbação e força. Lavar roupa envolve um prato de cultura com uma solução tampão de lavagem e transferir a solução com os animais através de uma pipeta Pasteur de vidro para uma nova placa de cultura. Este método é rápido e eficiente, mas não é exato, como várias gerações e estádios de desenvolvimento dos animais são transferidos em massa. Tratamentos químicos, tais como FUDR, podem ser dissolvidos na mídia cultivo para impedir a produção de descendência através de bloquear qualquer replicação do DNA e, portanto, o desenvolvimento de ovos e produção de gametas. Pouco eficaz, este método deve ser aplicado após a maturação do desenvolvimento como para não perturbar os processos do desenvolvimento normais, e isso significa que ainda há um requisito para transferir os animais antes da sua administração³. Esse método também influencia vários celulares vias de sinalização, resultando em efeitos visíveis dos animais com a idade (por exemplo, uma extensão de vida útil ou um proteostasis alterada) dependendo da cepa de c. elegans usado^{5, 6,7,8,9,10}. Métodos de citometria de fluxo automaticamente classificar e transferir individual c. elegans de uma placa multi bem para outro¹¹. Enquanto este método é muito eficaz e eficiente, equipamento de citometria de fluxo é proibitivamente caro e inacessível para muitos pesquisadores. Uma alternativa para transferência de animais é usar modelos mutantes que são sensível, tais como fer-15 e fem-1, que se tornam estéreis com ajuste de temperatura¹²de temperatura. Enquanto usar animais mutantes é útil em algumas situações, estas cepas específicas crescem mais lentamente do que os animais selvagem-tipo e eles contam com um genoma alterado, servindo como pobres representantes para vermes envelhecimento ou saudáveis. Além disso, a dependência de uma mudança de temperatura para induzir esterilidade também resulta na ausência de um ambiente estático, e mudanças de temperatura foram prontamente mostradas para influenciar o gene expressões^{13,14, 15}. grupos de pesquisa têm publicado anteriormente técnicas descrevendo o uso de uma malha para filtrar c. elegans por tamanho¹⁶. No entanto, fomos capazes de encontrar trabalhos anteriores testes para qualquer alteração nos resultados saúde geral podem ser associados com o uso de tais filtros.

Há, assim, uma necessidade um método acessível, eficiente, rápido e preciso para transferir um grande número de animais entre placas de cultura dentro da comunidade de pesquisa de c. elegans . Nós desenvolvemos uma peça melhorada, acessível do equipamento (chamado Caenorhabditis peneira) e um protocolo associado para sua manufatura e operação que atenda às necessidades da comunidade de pesquisa de c. elegans . Aqui, partilhamos o projeto do Caenorhabditis peneira e métodos para sua utilização, e demonstramos que seu uso não afeta a saúde comum ou qualquer marcadores de estresse quando comparado a colheita manual padrão e um tratamento com o comumente usados, restrição da fertilidade química FUDR.