Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen
Summary
Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.
Abstract
Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des permanenten Zellzyklus Festnahme in Reaktion auf verschiedene schädliche Reize aktiviert. Aktivierung der zellulären Seneszenz ist ein Markenzeichen von diversen pathophysiologischen Bedingungen auch den Tumor Unterdrückung, Gewebe, Umbau und Alterung. Die Induktoren der zellulären Seneszenz in Vivo zeichnen sich nach wie vor schlecht. Eine Reihe von Reizen kann jedoch verwendet werden, Förderung der zellulären Seneszenz ex Vivo. Darunter sind die häufigsten Seneszenz-Induktoren replikativen Erschöpfung, ionisierender und nichtionisierender Strahlung, genotoxisch Drogen, oxidativen Stress und demethylating und acetylieren Agenten. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Verwendung dieser Reize, um Fibroblasten in Seneszenz zu induzieren. Dieses Protokoll kann problemlos für verschiedene Arten von Primärzellen und Zelllinien, einschließlich Krebszellen angepasst werden. Wir beschreiben auch verschiedene Methoden für die Validierung der Seneszenz Induktion. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Messung der Aktivität des lysosomalen Enzyms Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-gal), die Rate der DNA-Synthese mit 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU) Einbeziehung Assay, die Höhe der Expression des Zellzyklus Inhibitoren p16 p21, und der Ausdruck und Sekretion von Mitgliedern der Senescence-Associated sekretorischen Phänotyp (SASP). Endlich, wir bieten Beispielergebnisse und besprechen weitere Anwendungen dieser Protokolle.
Introduction
Im Jahr 1961 berichtet Hayflick und Moorhead, dass primäre Fibroblasten in Kultur ihr proliferative Potential nach aufeinanderfolgenden Passagen1zu verlieren. Dieser Prozess wird durch die fortlaufende Verkürzung der Telomere nach jeder Zellteilung verursacht. Wenn die Telomere eine kritisch kurze Länge erreichen, sie sind anerkannt durch die DNA-Schäden-Antwort (DDR), die eine irreversible Verhaftung der Proliferation aktiviert – auch als replikative Seneszenz definiert. Replikative Seneszenz ist derzeit eines der vielen Reize, die bekannt sind, um einen Zustand der permanenten Zellzyklus Festnahme zu induzieren, die Zellen unempfindlich auf Mitogene und Apoptotic Signale2,3 macht. Die Seneszenz-Programm zeichnet sich normalerweise durch zusätzliche Eigenschaften einschließlich lysosomale hochaktiver, mitochondriale Dysfunktion, nukleare Änderungen, Chromatin Umgestaltungen, endoplasmatische Retikulum Stress, DNA-Schäden und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP)3,4. Alternde Zellen haben mehrere Funktionen im Körper: Entwicklung, Wunde heilen und Tumor Unterdrückung2. Ebenso sind sie bekannt, eine wichtige Rolle im Altern und paradoxerweise im Tumor Progression5. Die negativen und teilweise widersprüchlichen Auswirkungen der Seneszenz werden oft die SASP6zugeschrieben.
Vor kurzem zeigte sich, dass die Beseitigung der alternde Zellen von Mäusen zur Lebensdauerverlängerung und zur Beseitigung vieler der Alterung Funktionen7,8,9,10,11, führt 12. auf die gleiche Weise wurden mehrere Medikamente entwickelt, alternde Zellen (Senolytics) entweder zu beseitigen oder die SASP13,14Zielen. Das therapeutische Potenzial von Anti-Aging hat vor kurzem mehr Aufmerksamkeit auf das Feld angezogen.
Die Untersuchung der Mechanismen, die zelluläre Seneszenz zugeordnet und die Vorführungen für pharmakologische Interventionen angewiesen auf ex-Vivo -Modelle, vor allem auf menschliche primäre Fibroblasten. Zwar gibt es einige gemeinsame Merkmale, die durch vielfältige Seneszenz Induktoren aktiviert, ist eine große Variabilität in der Seneszenz Phänotyp beobachteten und abhängig von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Zelle Art, Impuls und Zeit Punkt3,15, 16,17. Es ist zwingend notwendig, um die Heterogenität für Studium und targeting seneszenten Zellen betrachten. Dieses Protokoll soll daher eine Reihe von Methoden zur Seneszenz in primäre Fibroblasten zu induzieren, indem mit verschiedenen Behandlungen zu bieten. Wie es erklärt wird, können die Methoden leicht zu anderen Zelltypen angepasst werden.
Abgesehen von replikative Seneszenz, beschreiben wir fünf Seneszenz-induzierende Behandlungen: ionisierende Strahlung, ultraviolettes (UV) Strahlung, Doxorubicin, oxidativer Stress und epigenetische Veränderungen (nämlich die Förderung von Histon Acetylierung oder DNA Demethylierung) . Ionisierende Strahlung sowohl UV-Bestrahlung direkte DNA-Schäden verursachen, und bei der entsprechenden Dosis auslösen Seneszenz18,19. Doxorubicin verursacht auch Seneszenz hauptsächlich durch DNA-Schäden durch verschuppen in die DNA und Topoisomerase-II-Funktion zu stören und damit stoppen DNA Reparatur Mechanismen20. Die Expression von Genen für Seneszenz wird normalerweise von Histon Acetylierung und DNA-Methylierung gesteuert. Folglich auslösen Histon-Deacetylase-Hemmer (z.B.Natrium-Butyrat und SAHA) und DNA-demethylating (z. B. 5-Aza) Agenten Seneszenz sonst normalen Zellen21,22.
Zu guter letzt vier der am häufigsten verwendeten Marker, die alternde Zellen erläutert werden: Aktivität der Seneszenz verbunden-β-Galaktosidase (SA-β-gal), Rate der DNA-Synthese durch EdU Einbeziehung Assay, Überexpression von den Regulatoren des Zellzyklus und Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitoren p16 p21, Überexpression und und Sekretion von Mitgliedern der SASP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier erläuterten Protokolle wurden optimiert für menschliche primäre Fibroblasten, besonders BJ und WI-38 Zellen. Die Protokolle für replikative Seneszenz, ionisierende Strahlung und Doxorubicin, worden erfolgreich angewandt, um andere Arten von Fibroblasten (HCA2 und IMR90) und in andere Zelltypen (nämlich neonatale Melanozyten und Keratinozyten oder iPSC-abgeleitete Herzmuskelzellen) in unserem Labor. Anpassungen für weitere Zelltypen können jedoch durch Anpassung einige Details wie die Anzahl der gesetzten …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder des Demaria Labors für fruchtbare Diskussionen und Thijmen van Vliet für den Austausch von Daten und das Protokoll auf der UV-induzierten Seneszenz.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
Riferimenti
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