Здесь описан метод для изоляции микрососудов мозга крыс и для подготовки проб мембраны. Этот протокол имеет явное преимущество производства обогащенного microvessel образцы с приемлемым белка выход из отдельных животных. Образцы могут затем использоваться для анализа надежных белка на мозг микрососудистой эндотелия.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является динамической барьер ткани, которая реагирует на различные раздражители, патофизиологические и фармакологические. Такие изменения, вытекающие из этих стимулов может значительно модулировать доставки лекарств в мозг и выдвижением, вызывают значительные трудности в лечении центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний. Многие BBB изменения, которые влияют на фармакотерапии, включать белки, которые локализованы и выражены на уровне эндотелиальных клеток. Действительно такие знания о физиологии BBB в здоровье и болезни вызвал значительный интерес к изучению этих мембранных белков. С точки зрения исследований фундаментальной науки это подразумевает потребность в простой, но надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, добываемых из подопытных животных. Чтобы подготовить образцы мембраны из свежевыделенных микрососудов, важно, что препаратов примере быть обогащенный в эндотелиальных клетках, но ограничены в присутствии других типов клеток, нервно-сосудистого подразделения (т.е., астроциты, микроглии, нейронов, pericytes). Дополнительным преимуществом является возможность готовить образцы из отдельных животных с целью захвата истинной изменчивость белков в экспериментальной населения. В этой рукописи предоставляются подробности относительно метода, который используется для изоляции микрососудов мозга крыс и подготовки образцов мембраны. Microvessel обогащения, от образцов, полученных, достигается с помощью четырех шагов центрифугирования, где декстрана включен в буфере выборки. Этот протокол может быть легко адаптирована в других лабораториях для их собственных конкретных приложений. Было показано, что образцы, созданные из этого протокола дают надежные экспериментальные данные от белка анализа экспериментов, которые могут значительно облегчить понимание BBB ответы на физиологические, патофизиологические и фармакологические стимулы.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) существует на стыке центральной нервной системы (ЦНС) и кровообращения и играет важную роль в поддержании гомеостаза головного мозга. В частности BBB функций для точного управления вещества концентрации в внеклеточной жидкости мозга и чтобы эффективно поставки этих питательных веществ, которые необходимы ткани мозга выполнять значительные метаболические требования ЦНС1. Эти роли подразумевают, что BBB, который существует в первую очередь на уровне микрососудистой эндотелиальных клеток, должны обладать дискретных механизмов, которые позволяют некоторые вещества, чтобы получить доступ к паренхимы мозга, обеспечивая, что может потенциально опасные ксенобиотики накапливаются. Действительно микрососудистой эндотелиальные клетки мозга не перфорированную и выставку ограниченное Пиноцитоз, которая обеспечивает отсутствие неизбирательной проницаемости2. Кроме того эндотелиальные клетки мозга microvessel Экспресс туго junction и adherens перекрестка белки, которые действуют в форме физического «печать» между соседними эндотелиальных клеток и значительно ограничивают параклеточный диффузии веществ кровь в мозг паренхимы. Действительно селективный проницаемость эндогенных и экзогенных веществ требует функциональных выражение поглощения и измеряем транспортеры3. В целом, туго развязок, adherens развязок и транспортеры работают в концерте для поддержания уникальных барьерные свойства BBB.
BBB является динамической барьер, который реагирует на физиологические, патофизиологические и фармакологические раздражителей. Например было показано модулировать выражение критических туго Джанкшен белков (т.е., occludin, ресничный occluden-1 (ZO-1)), который связан с повышенной параклеточный проницаемости сосудистой маркеров таких гипоксии/реоксигенацию стресс как сахароза4,5,6. Аналогичные замечания были сделаны на уровне BBB в параметре черепно-мозговой травмы7 и периферические воспалительные боли8,9. Эти же заболевания также могут модулировать транспортных механизмов BBB10,11,12,,1314. Действительно, гипоксии/реоксигенацию травмы повышает функциональные выражения органических анионов, транспортировки 1a4 полипептид (Oatp1a4) на BBB, которые могут привести к значительным увеличением крови к мозгу перевозки конкретных Oatp транспорта субстратов такие как 13taurocholate и аторвастатина. BBB свойства также могут быть изменены по фармакотерапии, механизм, который может стать основой для обоих глубокие изменения в эффективности препарата в головном мозге и наркотиков лекарственных взаимодействий. Например ацетаминофен цели ядерных рецепторов сигнальных механизмов в микрососудистой эндотелиальных клеток головного мозга, увеличивает функциональные выражения критических измеряем транспортера Р-гликопротеина (P-gp) и изменяет время зависимых анальгезии предоставленных морфина, опиоидов болеутоляющие наркотиков и установленным P-gp транспорт субстрат15. Глубокое понимание BBB изменений, которые могут быть индуцированных заболеваний или наркотиков, также требует определения и характеристик конкретных механизмов регулирования, которые контролируют эти изменения. Действительно, было выявлено дискретных сигналов пути в мозг микрососудистой эндотелиальных клеток, которые контролируют молекулярных выражение туго съезда белки16,17 и транспортеры15, 18,19. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что сложные молекулярные пути участвуют в регуляции BBB плотные соединения и транспортеров в здоровье и болезни.
Значительные трудности в изучении BBB является абсолютным требованием простой и эффективный метод для изоляции микрососудов из ткани мозга, полученных экспериментальных животных и последующей подготовки образцов мембраны. Эти образцы должны быть готовы, так что они являются обогащенный микрососудистой эндотелиальных клеток мозга и ограничены в присутствии других типов клеток. За последние несколько лет в научной литературе13,20,,2122были зарегистрированы несколько методик для изоляции microvasculature от грызунов мозга. Эта статья описывает простой, надежный и воспроизводимый метод для изоляции микрососудов от мозга крысы и для подготовки эндотелиальной мембраны обогащенный образцов, которые могут использоваться для анализа выражения протеина. Преимуществом этого протокола изоляции microvessel является возможность получения образца препаратов высокого качества и с достаточно белка урожая от отдельных экспериментальных животных. Это дает возможность рассмотрения изменчивости между животных в выражении протеина. Такое продвижение в этом протоколе значительно улучшилась надежности ВВВ исследований потому, что теперь можно избежать чрезмерной оценки (или недооценки) истинного масштаба изменений белка на BBB. Кроме того включение нескольких шагов центрифугирования с декстрана позволяет улучшенная обогащения микрососудов в экспериментальных образцов при облегчении удаления нежелательных клеточных компонентов таких нейронов.
В этой статье описан простой и эффективный метод подготовки образцы протеина мембраны из микрососудов, свежезаваренным изолированы от ткани мозга крысы. Несколько подходов для изоляции микрососудов мозга крыс и/или поколение мембранных препаратов от изолированных microvasculature поступил?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здравоохранения (R01-NS084941) и биомедицинских исследований Комиссии Аризона (ADHS16-162406) PTR. WA получил прошлом поддержки от предварительного докторских назначение национальных институтов здравоохранения обучения Грант (T32-HL007249).
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |