Summary

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Published: July 15, 2018
doi:

Summary

Besmetting tijdens de genomic sequencing van microscopische organismen blijft een groot probleem. Hier, laten we een methode om het genoom van een beerdiertjes uit een enkel exemplaar met zo weinig als 50 pg van genomic DNA zonder het hele genoom versterking om te minimaliseren van het risico van besmetting.

Abstract

Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die worden ingevoerd door de staat van een ametabolic genaamd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging en kan hun oorspronkelijke staat te herstellen wanneer water wordt aangevoerd. Het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine dieren zoals beerdiertjes risico’s bacteriële besmetting dat soms tot verkeerde interpretaties, bijvoorbeeld met betrekking tot de omvang van horizontale genoverdracht in deze dieren leidt. Hier bieden we een ultralow input-methode om het genoom van de beerdiertjes, Hypsibius dujardini, van een enkel exemplaar. Door gebruik te maken van strenge wassen en verontreinigingen uitsluiting samen met een efficiënte winning van de 50 ~ 200 pg genomic DNA van een enkel individu, we gebouwd een bibliotheek sequenced met een DNA-sequencing-instrument. Deze bibliotheken waren zeer reproduceerbaar en onbevooroordeelde, en een analyse van de informatica van de gesequenceerd luidt met andere H. dujardini -genoom toonden een minimale hoeveelheid verontreiniging. Deze methode kan worden toegepast op unculturable beerdiertjes die niet kon worden sequenced met behulp van de vorige methoden.

Introduction

Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die een ametabolic staat genoemd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging kunnen worden ingevoerd. Zij herstellen door de absorptie van water1,2. In de ametabolic staat kunnen beerdiertjes gedogen van verschillende extreme omgevingen, waaronder extreme temperaturen3 en druk4,5, een hoge dosering van ultraviolet licht6, x-stralen en gammastralen 7 , 8en9van de kosmische ruimte. Genomic gegevens is een onmisbaar fundament voor de studie van moleculaire mechanismen van anhydrobiosis.

Eerdere pogingen om het genoom van beerdiertjes is gebleken tekenen van bacteriële besmetting10,11,12,13,14. Genoom sequentiebepaling van dergelijke kleine organismen vereist een groot aantal dieren en is gevoelig voor bacteriële besmetting; Daarom hebben we een protocol van de sequencing met behulp van een ultralow invoermethode vanaf een enkel exemplaar van beerdiertjes, tot een minimum beperken van het risico van verontreinigingen15eerder opgericht. Met behulp van deze gegevens, hebben we verder uitgevoerd een kwalitatief hoogwaardige manipulatie en de opbouw van het genoom van H. dujardini16,17. Hier beschrijven we in detail deze methode voor het genomic rangschikken van een individu tardigrade ()Figuur 1). De validatie van deze methode sequencing is voorbij de focus van dit papier en is reeds grondig besproken in ons vorige verslag16.

Deze methode bestaat uit twee delen: de isolatie van een enkele beerdiertjes met de laagst mogelijke verontreiniging en de kwalitatief hoogwaardige extractie van pictogram niveaus van DNA. De beerdiertjes is uitgehongerd en grondig gespoeld met water, evenals antibiotica en waargenomen onder een microscoop met vergroting van 500 X om het verwijderen van eventuele bacteriële besmetting. Eerdere schattingen en metingen tonen aan dat een enkel individu van beerdiertjes ongeveer 50-200 pg genomic DNA16, die is geëxtraheerd bevat door het kraken van chitine exoskeleton door cycli bevriezen-ontdooien of door handmatige homogenisering. Deze genomic DNA is voorgelegd aan de bouw van de bibliotheek en sequenced op een DNA-sequencing-instrument. Een extra informatica-analyse toont kwalitatief hoogwaardige sequencing, evenals lage niveaus van verontreiniging in vergelijking met eerdere tardigrade sequencing projecten.

Protocol

1. voorbereiding Bereiden van 2% agarose gel met gedestilleerd water (DW) als het oplosmiddel in een 90-mm kunststof cultuur schotel, en 10 mL van een 1% penicilline/streptomycine cocktail met DW. De gel kan worden opgeslagen voor 2-3 weken in een couveuse ingesteld bij 18 ° C.Opmerking: Vermijd elke opslag van de gel onder 10 ° C, voor de lage temperatuur zal het krimpen van het agarose gel, resulterend in een minuscuul kloof tussen de gel en de cultuur schotel muur waarin de beerdiertjes opgesloten kunn…

Representative Results

Verontreinigingen uitsluiting: Dit protocol omvat een grondige wassen van de beerdiertjes en een sterilisatie met antibiotica behandeling tot een minimum beperken van verontreiniging. Het gaat ook om een visuele controle proces om ervoor te zorgen de volledigheid van deze processen. Een afbeelding van de Microscoop gemaakt tijdens de validatie (stap 2.4 van het protocol) is afgebeeld in Figu…

Discussion

Bacteriële besmetting vormt een bedreiging voor het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine organismen. Hoewel eerdere studies op tardigrade genoom sequencing hebt gefilterd uit besmetting met behulp van uitgebreide informatica methoden12,20, sequenced we het genoom van een individu om te minimaliseren van het risico van verontreinigingen. Aangezien een individuele beerdiertjes bevat ongeveer 50-200 pg genomic DNA16 en is ingeka…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Nozomi Abe, Yuki Takai en Nahoko Ishii voor hun technische ondersteuning in genomic sequencing. Dit werk werd gesteund door de Grant-in-Aid voor de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (No.22681029) en KAKENHI Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (B), No. 17 H 03620 van de JSPS, door een Subsidie voor elementaire wetenschap-onderzoeksprojecten uit The Sumitomo Foundation (No.140340), en deels door de middelen voor onderzoek van de departementale overheid Yamagata en Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris gebruikt om te voeden de beerdiertjes was voorzien hoffelijkheid van Chlorella Industry Co. LTD.

Materials

SZ61 microscope OLYMPUS
BactoAgar Difco Laboratories 214010
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco by life technologies 15140-148
VHX-5000 System Keyence
0.2mL Silicone coating tube Bio Medical Science BC-bmb20200
Quick-DNA Microprep Kit ZYMO Research D3021 Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1
1.5 mL microtube greiner bio-one 616-201 See 4.1.1
HIgh speed refrigerated micro centrifuge TOMY MX-307
Covaris M220 Covaris Inc. 4482277
ThruPLEX DNA-Seq kit Rubicon Genomics CAT. NO. R400406 Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2
Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC
AMPure XP reagent BECKMAN COULTER Life Science A63881
Ethanol Wako 054-027335
EB buffer QIAGEN 19086
2200 TapeStation Agilent G2965AA 
D1000 Reagents Agilent 5067-5583
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582
Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent ThermoFisher Scientific Q32850
Cubee Mini-Centrifuge RecenttecGenereach R5-AQBD01aqbd
MiSeq 600 cycle v3 Illumina Inc. MS-102-3003
MiSeq Sequencer Illumina Inc. SY-410-1003

Riferimenti

  1. Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
  2. Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
  3. Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
  4. Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
  5. Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
  6. Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
  7. Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
  8. May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
  9. Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
  10. Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
  11. Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
  12. Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
  13. Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
  14. Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
  15. Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
  16. Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
  17. Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
  18. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
  19. Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
  20. Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
  21. Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
  24. Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).

Play Video

Citazione di questo articolo
Yoshida, Y., Konno, S., Nishino, R., Murai, Y., Tomita, M., Arakawa, K. Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen. J. Vis. Exp. (137), e57615, doi:10.3791/57615 (2018).

View Video