Summary

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Published: May 04, 2018
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Summary

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Abstract

Transporte de elétrons da membrana trans-plasma (tPMET) desempenha um papel na proteção das células do stress redutivo intracelular, bem como a proteção contra danos por oxidantes extracelulares. Este processo de transporte de elétrons do redutores intracelulares para o extracelulares oxidantes não é bem definido. Aqui apresentamos os ensaios espectrofotométricos por C2C12 myotubes para monitorar tPMET utilizando os aceitadores de electrões extracelular: sal de tetrazólio solúvel em água-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP ou DCIP). Através da redução destes aceitadores de electrões, somos capazes de monitorar este processo em uma análise em tempo real. Com a adição de enzimas como ascorbato oxidase (AO) e superóxido dismutase (SOD) para os ensaios, podemos determinar qual parte do tPMET é devido à produção de exportação ou superóxido de ascorbato, respectivamente. Enquanto WST-1 foi mostrado para produzir resultados estáveis com baixo fundo, DPIP era capaz de ser re-oxidado após a adição do AO e SOD, que foi demonstrado com análise espectrofotométrica. Este método demonstra um ensaio espectrofotométrico em tempo real, multi bem, rápido, com vantagens sobre outros métodos usados para monitorar tPMET, tais como o ferricianeto (BECN) e redução de c ferricytochrome.

Introduction

A visão de que a membrana plasmática tem uma capacidade inerente redox1levou a capacidade das membranas de plasma purificadas de reduzir aceitadores de electrões. Visto anteriormente em fungos, plantas e animais, o tPMET é um processo comum a vários organismos2,3,4,5. Especificamente, este processo tem sido demonstrado em Saccharomyces cerevisiae, cenoura células, hemácias, linfócitos, osteossarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético e neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. em um processo que transporta elétrons através da membrana de plasma para reduzir oxidantes extracelulares, tPMET está envolvido em muitas funções celulares, incluindo: célula crescimento5,8, de viabilidade celular9, ferro metabolismo10, sinalização11,12,13e proteção de1514,12,do espécies reactivas de oxigénio celular. Devido ao envolvimento do tPMET em muitas funções celulares, um desequilíbrio de tPMET tem sido hypothesized para contribuir para o desenvolvimento de algumas condições graves de saúde, incluindo câncer16, doença cardiovascular,17e metabólica Síndrome de18.

Existem várias maneiras de monitorar a transferência de electrões através da membrana de plasma, mas a técnica mais utilizada é avaliar a redução de aceitadores de electrões extracelular através de ensaios colorimétricos. Aceitadores de electrões extracelular comumente usados são sais de tetrazólio, DPIP, BECN e ferricytochrome c19,20. O sal de tetrazólio mais comumente usado é um conhecido sal da segunda geração como WST-119. Este composto é mais fácil de utilizar em ensaios colorimétricos comparados com sais de tetrazólio primeira geração devido a dois grupos sulfonato, que aumentam sua solubilidade de água21. WST-1, em conjunto com o methosulfate de 1-metoxi-Fenazina aceitador elétrons intermediários (mPMS), é reduzido em eventos de transferência de elétron dois. Esta redução altera a forma oxidada fraca-colorido do WST-1 para um mais intenso, amarelo formazan20,22. WST-1 possui um coeficiente de extinção molar elevada de 37 x 103 M-1cm-1, levando a um ensaio de alta sensibilidade21,22. DPIP é também utilizado como um aceitador do elétron extracelular para monitorar tPMET. Tem sido demonstrado que DPIP pode ser diminuído extracelularmente tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário23,24. Devido à falta de aceitadores de electrões intermediário, DPIP pode diretamente a pick-up os elétrons da membrana plasmática, ao contrário do WST-124. Semelhante a DPIP, BECN foi mostrado para ser diminuído extracelularmente para ferrocianeto de tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário19,24. Ao contrário do WST-1 e DPIP, BECN tem um coeficiente de extinção molar baixa, levando a uma baixa de sensibilidade de ensaio9. Outra aceitador de electrões extracelular comumente usados para monitorar tPMET é c ferricytochrome semelhante a WST-1, ferricytochrome c redução aumenta com o uso do aceptor de elétrons intermediários, mPMS22. Ao contrário do WST-1, o método de ferricytochrome c é menos sensível devido a um fundo elevado e um coeficiente de extinção molar baixa22.

Aqui nós apresentamos um método de análise em tempo real de tPMET através de ensaios espectrofotométricos. O método utilizado os aceitadores de electrões extracelular WST-1 e DPIP, que tenham um coeficiente de extinção molar alta enquanto ser menos caro em comparação com o outro comumente usado aceitadores de electrões extracelular como ferricytochrome c. Utilizamos o methosulfate Fenazina (PMS) em vez de mPMS têm uma composição química semelhante e PMS é muito menos dispendioso. mPMS fotoquimicamente estável que é uma característica importante para um kit comercial que tem uma vida útil longa. No entanto, fazemos PMS fresco para cada ensaio, por estabilidade não deve ser um problema. Também apresentamos um método para avaliar possíveis interações enzimáticas (ver Figura 1) entre o aceitador de electrões extracelular e enzimas que podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais o processo de tPMET. Especificamente, as enzimas AO e SOD podem ser usado determinam qual parte do tPMET é devido ao transporte de ascorbato ou liberação de superóxido extracelular, dois métodos comuns para elétrons ser transportado através da membrana plasmática.

Protocol

Nota: Consulte a Figura 1 para uma visão esquemática das principais etapas. 1. ensaio de redução WST-1 Crescem e se diferenciam células aderentes C2C12, usando de procedimentos de cultura de célula padrão7 em uma placa de 96 poços utilizando linhas A-F. Use um meio de diferenciação consistindo de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 2% de soro de cavalo, 100 U/mL penicilina e estreptomicin…

Representative Results

As estatísticas foram realizadas com ANOVA com medidas repetidas utilizando RStudio software estatístico25. Tamanhos de amostra são indicados nas lendas figura. Para monitorar tPMET, C2C12 myotubes foram utilizados juntamente com aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP. AO foi usado para determinar qual parte do WST-1 e redução de DPIP foi devido ao efluxo de ascorbato e SOD foi usada pa…

Discussion

Apresentamos dois métodos para a utilização de aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP, em ensaios espectrofotométricos para monitorar tPMET em C2C12 myotubes. Com o crescimento de linhagens celulares em procedimentos padrão de cultura e um leitor de placa de espectrofotômetro, é possível monitorar tPMET com estes aceitadores de electrões em um ensaio de microplacas simples. WST-1 redução é reprodutível de para-bem dentro de um ensaio, mas não há variabilidade do dia a dia. O dia-a-coeficiente…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer seu apoio técnico Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de serviço de saúde pública dos Estados Unidos R15DK102122 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças do rim (NIDDK) e digestivo para Jonathan Fisher. O conteúdo do manuscrito é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDDK ou o National Institutes of Health.

Materials

C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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Citazione di questo articolo
Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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