Descreveremos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII Lambda selecione em culturas de células de roedores transgênicos ou correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos.
Um número de modelos de animais transgênicos e sistemas de deteção de mutação foram desenvolvido para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos. Destes, ratos transgénicos e o Lambda (λ) Select cII sistema de deteção de mutação têm sido empregadas para experimentos de mutagenicidade por muitos grupos de pesquisa em todo o mundo. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o ensaio de mutação de cII selecione Lambda, que pode ser aplicado às células cultivadas de mouses/ratos transgénicos ou os correspondentes animais tratados com um agente químico/físico de interesse. O protocolo consiste das seguintes etapas: (1) isolamento do DNA genômico das células ou tecidos/órgãos de animais transgénicos trataram em vitro ou na vivo, respectivamente, com um composto de teste; (2) recuperação do vetor shuttle lambda carreg um gene repórter mutacional (ou seja, cII transgene) partir do DNA genômico; (3) embalagem dos vetores resgatados em bacteriófagos infecciosas; (4) infectar uma bactéria de acolhimento e cultivo seletivo condições para permitir a propagação das mutações induzidas cII ; e (5) marcando a cII-mutantes e DNA sequência análise para determinar a frequência de mutação cII e espectro de mutação, respectivamente.
Uma ampla gama de modelos de animais transgênicos e sistemas de deteção de mutação foram desenvolvidos para testes de mutagenicidade de substâncias cancerígenas em células de mamíferos. Destes, ratos transgénicos Big Blue (referido daqui em diante como BB) e o λ Select cII sistema de deteção de mutação têm sido empregadas para experimentos de mutagenicidade por este grupo e muitos outros pesquisa grupos em todo o mundo1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Nos últimos 16 anos, temos investigado os efeitos mutagênicos de diversos agentes químicos e/ou físicos usando esses animais transgénicos ou suas correspondentes culturas de células embrionárias fibroblastos tratadocom com um composto de teste e posteriormente analisaram os fenótipo e genótipo do transgene cII pelo ensaio λ Select cII e sequenciamento de DNA, respectivamente,10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. o genoma destes animais transgénicos contém um vetor de transporte λ do bacteriófago (λLIZ) integrado no cromossoma 4 como uma concatemer de cabeça-de-cauda multi cópia1,2,25. O vetor de transporte λLIZ carrega dois genes repórter mutacional, nomeadamente o Laureano e cII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,,43,44,45 , 46 , 47. o ensaio de Select cII λ baseia-se na recuperação dos vetores de transporte de λLIZ de DNA genômico de células derivadas de tecidos/órgãos de animais transgénicos1,2,25 . Os vetores de transporte λLIZ recuperados são então embalados nas cabeças do fago λ capazes de infectar um host indicador Escherichia coli. Posteriormente, as bactérias infectadas são cultivadas em condições seletivas para permitir a análise de mutações no cII transgene1,3e marcando.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o ensaio de Select cII λ, que consiste de isolamento do DNA genômico de células/órgãos de animais transgénicos tratados em vitro/na vivo com uma teste de recuperação composto, da λLIZ shuttle vetores partir do DNA genômico, embalagem dos vetores em fago λ infecciosas, infecção do hospedeiro e. coli com os bacteriófagos, identificação da cII-mutantes sob condições seletivas para determinar a frequência de mutação de cII , e Análise de sequências de DNA para estabelecer o espectro de mutação de cII . O protocolo pode ser aplicado a do mouse/rato transgénico célula culturas tratadas em vitro com um agente químico/físico de interesse, ou tecidos/órgãos dos animais correspondentes tratados na vivo com o teste químico/agente1, 2,4,,48,,49,50,51,52. Uma apresentação esquemática do ensaio λ Select cII é mostrada na Figura 1.
O ensaio de Select cII λ é usado para detecção de mutações no transgene cII recuperadas o DNA genômico de células derivadas de tecidos/órgãos de roedores de BB3. O genoma destes animais transgénicos contém várias cópias em tandem do vetor cromossomicamente integrado λLIZ shuttle, que transporta a cII (294 bp) e Laureano (1.080 bp) transgenes, como o repórter mutacional genes1, 2 ,</s…
The authors have nothing to disclose.
Nós gostaríamos de reconhecer as contribuições de todos os colegas e colaboradores para nossos estudos originais, cujos resultados têm sido referidos neste manuscrito (para fins ilustrativos). O trabalho dos autores é suportado por doações do Instituto Nacional de dentárias e craniofaciais pesquisa do National Institutes of Health (1R01DE026043) para AB e pela Universidade do programa de pesquisa de doença California Tobacco-Related a AB ( TRDRP-26IR-0015) e ST (TRDRP-25IP-0001). Os patrocinadores do estudo não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados, análise de dados, interpretação dos dados, redação do relatório, ou na decisão de enviar para publicação.
Agar | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | Bacteriological grade |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | None |
Casein Peptone | Alfa Aesar | H26557 | None |
Gelatine | J. T. Baker | 2124-01 | Powder |
Glycerol | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | None |
LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | None |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 8104 | 50 PCR purification reactions |
Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | M-15756 | None |
Taq5000 DNA Polymerase | Qiagen | 201207 | None |
Thiamine Hydrochloride | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | None |
Transpack Packaging Extract | Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 packaging reactions |
Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | None |
Trypton | Biosciences | RC-110 | None |