Visualisering av mobilnettet elektrisk aktivitet i sebrafisk tidlig embryo og svulster
Summary
Her viser vi å lage en mobilnettet strømstyrken reporter sebrafisk linje for å visualisere embryonale utviklingen, bevegelse, og fisk tumor celler i vivo.
Abstract
Bioelectricity, endogen elektrisk signalering formidlet av ionekanaler og pumper på cellemembranen, spiller viktige roller i signalering prosesser av nervøs neuronal og muskel celler og mange andre biologiske prosesser, som embryonale utviklingsmessige mønstre. Men er det behov for i vivo elektrisk aktivitet overvåking i virveldyr embryogenesis. Fremskritt i genetisk kodet fluorescerende spenning indikatorer (GEVIs) har gjort det mulig å gi en løsning på denne utfordringen. Her beskriver vi hvordan du oppretter en transgene spenning indikator sebrafisk bruker indikatoren etablerte spenning, ASAP1 (akselerert Sensor av handlingen potensialer 1), som et eksempel. Tol2 kit og en allestedsnærværende sebrafisk promoter, ubi, ble valgt i denne studien. Vi har også forklare prosessene av Gateway områdespesifikke kloning, Tol2 transposon-baserte sebrafisk transgenesis og avbildingsprosessen for tidlig stadium fisk embryoer og fisk svulster bruk av vanlig epifluorescent mikroskop. Bruker denne fisken linjen, fant vi at det er mobilnettet strømstyrken endringer under sebrafisk embryogenesis og fisk larver bevegelse. Videre ble det observert at i noen sebrafisk ondartet perifere nerve skjede svulster, svulst cellene var generelt polarisert forhold til de omliggende normalt vev.
Introduction
Bioelectricity refererer til endogene elektrisk signalering formidlet av ionekanaler og pumper ligger på cellemembranen1. Ioniske utveksling mobilnettet membranen og kombinert elektrisk potensielle og nåværende endringene, er avgjørende for signalering prosesser av nervøs neuronal og muskel celler. I tillegg har bioelectricity og ion graderinger en rekke andre viktige biologiske funksjoner inkludert energilagring, biosyntesen og metabolitten transport. Bioelektrisk signalering ble også oppdaget en regulerende embryonale mønster formasjonen, som kroppen akser, cellen syklus og celle differensiering1. Derfor er det avgjørende for å forstå mange menneskelige medfødte sykdommer som følge av mis regulering av denne typen signalering. Selv om oppdateringen klemme har vært mye brukt for opptak enkeltceller, er det fortsatt langt fra ideell for samtidig overvåking av flere celler under embryonale utviklingen i vivo. Videre er spenning følsom små molekyler heller ikke perfekt for programmer i vivo sine særegenheter, følsomhet og toksisitet.
Etableringen av en rekke genetisk kodet fluorescerende spenning indikatorer (GEVIs) tilbyr en ny mekanisme for å overkomme dette problemet, og muliggjør enkel bruk å studere embryonale utvikling, selv om de var opprinnelig ment for overvåking nevrale 2,3i cellene. En av de tilgjengelige GEVIs er akselerert Sensor av handlingen potensialer 1 (ASAP1)4. Det består av en ekstracellulære løkke av et spenning-sensing domene spenning følsom fosfatase og et sirkulært permuted grønne fluorescerende protein. Derfor ASAP1 lar visualisering av mobilnettet elektrisk mulige endringer (polarisering: lys grønn; depolarization: mørk grønn). ASAP1 har 2 ms-og-på kinetics og kan spore subthreshold potensielle endre4. Dermed gir genetisk verktøyet et nytt nivå av effekt i real-time bioelectric overvåking i levende celler. Videre forståelse av rollene til bioelectricity i embryonale utvikling og mange menneskelige sykdommer som kreft, vil kaste nytt lys over de underliggende mekanismene som er avgjørende for behandling og forebygging.
Sebrafisk har vist en kraftig dyremodell utviklingsbiologi og menneskelige sykdommer, inkludert kreft5,6. De deler 70% orthologous gener med mennesker, og de har lignende virveldyr biologi7. Sebrafisk gir relativt enkel pleie, en stor clutch størrelse på egg, medgjørlig genetikk, lett transgenesis og gjennomsiktig eksterne embryonale utvikling, som gjør dem et bedre system for i vivo tenkelig5,6. Med en stor kilde til mutant fisk linjene allerede finnes og et fullt sekvensert genom, vil sebrafisk gi en relativt ubegrenset rekke vitenskapelige funn.
Undersøke i vivo sanntid elektriske aktiviteten til cellene, tar vi nytte av sebrafisk modell systemet og ASAP1. I dette papiret, vi beskriver hvordan å innlemme fluorescerende spenning biosensor ASAP1 i sebrafisk genomet bruker Tol2 transposon transgenesis, og visualisere mobilnettet elektrisk aktivitet under embryonale utviklingen, fisk larver bevegelse, og i live svulst .
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om de cellular og vev nivå elektriske aktivitetene under embryonale utvikling og menneskelig sykdom ble oppdaget for lenge siden, fortsatt i vivo dynamisk elektrisk endringene og deres biologiske roller hovedsakelig ubekjent. En av de store utfordringene er å visualisere og kvantifisere elektrisk endringene. Oppdateringen klemme teknologi er et gjennombrudd for sporing enkeltceller, men sin søknad til virveldyr embryoer er begrenset fordi består av mange celler. De gjeldende kjemiske spenning fargestoff…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsarbeid i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under prisen tall R35GM124913, Purdue University PI4D insentivprogram og PVM interne konkurransedyktig Grunnforskning midler programmet. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av finansiering agenter. Vi takker Koichi Kawakami for den Tol2 konstruksjonen, Michael Lin for den ASAP1 konstruksjonen, og Leonard Zon for ubi arrangøren konstruere gjennom Addgene.
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
Riferimenti
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
